多肉植物开花调控蛋白TFL及其编码基因与应用的制作方法

• 花匠小妙招
• 2024-12-18 12:13

本发明涉及分子生物学中的基因技术领域，属于植物基因工程技术领域，具体涉及多肉植物开花调控蛋白tfl及其编码基因与应用。

背景技术：

多肉植物是指植物某一或者多个营养器官肥大的高等植物，通常具根、茎、叶三种营养器官和花、果实、种子三种繁殖器官。在园艺上，又称肉质植物或多肉花卉，但以多肉植物这个名称最为常用。肥大的营养器官具有发达的薄壁组织，可以储藏水分。多肉植物是少有的利用景天酸代谢途径的植物，即夜间可以吸收二氧化碳，因此可以作为室内绿植用于夜间净化室内的二氧化碳。多肉植物生长环境相对简单，耐旱耐寒，养殖容易，外形漂亮，色彩绚丽多姿，品种繁多，长相憨厚可爱，养护起点低，近年来，借助互联网的大力宣传，多肉植物在较短时间内被大众熟知、喜爱，继而开始风靡全国。已经成为一个良好的创业项目。

多肉植物的花同样具有观赏作用，同时开花后所结的种子，可以用于品种保存和繁殖后代。开花后还可以通过人工杂交而有目的的选育新的品种，丰富多肉植物种植资源。因此发掘多肉植物开花的分子调控机制，为多肉植物花期的精准调控奠定重要基础。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决光周期调控多肉植物开花问题，提供了多肉植物开花调控蛋白tfl及编码基因，以及促进景天科多肉植物的开花方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种多肉植物开花调控蛋白tfl，所述多肉植物开花调控蛋白tfl的氨基酸序列是seqidno.3所示的蛋白质。

编码上述多肉植物开花调控蛋白tfl的编码基因，其编码序列是seqidno.1所示的cdna分子；或与seqidno.1序列具有80％以上同一性，且编码上述蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。

上述编码基因的基因编码区如seqidno.2所示。

上述编码基因在调控多肉植物花期中的应用，用于培育开花期提前的转基因多肉植物。

本发明还提供了一种培育花期提前的转基因多肉植物的方法，将上述的蛋白tfl编码基因导入植物受体，该编码基因在受体中过表达，获得花期早于该植物受体的转基因多肉植物。

在本发明的实施例中，所述蛋白质的编码基因(即序列表中seqidno.1所示的dna分子)通过含有编码上述蛋白质的核酸分子的表达盒的重组载体导入所述受体植物中。

上述方法中所述花期为多肉植物生长出花序至花序上开第一朵花的时间。

上述方法中所述植物受体为景天科拟石莲花属多肉植物。

本发明取得的有益效果是：

本发明的技术方案中采用cdna文库构建、pcr扩增技术和race技术，从景天科拟石莲花属多肉植物赫斯塔(echeveriaherstal)中获得了tfl基因。该基因在多肉植物的花期调控中发挥了关键作用，尤其是花序出现后的开花进程。

本发明首次对多肉植物的花期调控基因进行了研究，本发明建立的实用、稳定的多肉植物开花诱导模型，有利于对多肉植物成花基因表达模式的分析，对培育新型开花型观赏多肉植物提供了完整的操作和评价体系。

附图说明

图1是实施例1多肉植物赫斯塔总rna提取的电泳结果。

图2是实施例1多肉植物赫斯塔tfl基因中间片段pcr扩增结果；其中泳道1为dna分子量marker，泳道2为目的基因片段。

图3是实施例1阳性重组质粒的tfl基因中间片段鉴定的电泳结果，选择泳道4、5所示对应重组菌送华大基因公司进行测序。

图4、图5分别是实施例2赫斯塔tfl基因5’-race片段pcr扩增结果、阳性重组质粒的tfl基因5’-race片段的电泳结果。

图6、图7分别是实施例2赫斯塔tfl基因3’-race片段pcr扩增结果、阳性重组质粒的tfl基因3’-race片段的电泳结果。

图8、图9分别是实施例2赫斯塔tfl基因完整序列pcr扩增结果、阳性重组质粒的tfl基因完整序列的电泳结果。

图10是实施例4构建阳性重组质粒的tfl基因完整序列的电泳结果。

图11是实施例3多肉植物赫斯塔基因tfl同源性比对分析结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配制。

克隆基因末端race试剂盒race5’/3’kit(货号634913)，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

invitrogentmtrizol试剂盒(货号15596026)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

fasttrack2.0mrna分离试剂盒(货号k159202)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

cloneminerⅱcdna文库构建试剂盒(a11180)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

high-fidelitydnapolymerase及配套缓冲液(货号m0530l)，购自英格兰生物实验室公司neb。

qiaquickgelextractionkit(qiagen，德国)。

pro扩增仪(eppendorf，德国)。

cdnasizefractionationcolumns(货号18092015)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

pmd18t载体(货号6011)，购自宝日医生物技术(北京)有限公司。pdonr222载体购自上海沪震实业有限公司。大肠杆菌dh5a购自天根生化科技有限公司。dh10b感受态细胞购自北京博迈德基因有限公司。

序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；序列测序由华大基因(深圳)有限公司完成。

一、多肉植物开花调控蛋白tfl基因的同源克隆

实施例1多肉植物赫斯塔花基因cdna文库构建

1.本实施例选用的材料为景天科拟石莲花属多肉植物赫斯塔(echeveriaherstal)的花蕾。利用gateway技术构建赫斯塔全长cdna文库，利用该文库进行表达序列标签est测序，获得唯一表达序列。

为了进一步诱导与开花相关的基因表达，获得更多的有用基因，实验中对多肉植物进行红光补光处理，每天10h以上，避免强日照暴晒，选择多肉植物叶间距小、叶片肥厚、叶片变色的植株，采集花蕾。用invitrogentmtrizol试剂盒提取总rna，提取方法按着trizol使用说明书进行，所获得的总rna，利用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒将基因组dna去除以防rna污染，然后用1％琼脂糖凝胶电泳确认所提取rna的质量，如图1所示，泳道1、2、3分别三次样本所提取的花蕾总rna电泳检测结果。选择泳道1所对应总rna，使用fasttrack2.0mrna分离试剂盒，按照说明书对样本总rna进行mrna分离纯化。

对mrna纯化后，使用cloneminerⅱcdna文库构建试剂盒构建cdna文库(按试剂盒操作手册操作)。合成双链cdna后，加入dna聚合酶补齐双链cdna末端，使双链cdna平末端化，再利用t4dna连接酶将双链cdna的3’末端连接上attb1序列。将上述产物利用cdnasizefractionationcolumns分离，收集400-3000bp之间的cdna。将收集的双链cdna与pdonr222质粒混合，通过bp重组反应连接载体。将连接产物电击转化进dh10b感受态细胞，将菌液涂布soc琼脂平板，挑取100个单菌落送交华大基因有限公司进行测序。

对测序所得序列进行分析，获得一个长500bp，其核苷酸序列为seqidno.4所示的基因片段。

2.为了验证上述所得seqidno.4所示的基因片段的真实性，根据seqidno.4所示的基因片段序列信息，设计正向引物tflf1和反向引物tflr1。

对多肉植物进行红光补光处理，每天10h以上，避免强日照暴晒，选择多肉植物叶间距小、叶片肥厚、叶片变色的植株，采集花蕾，用invitrogentmtrizol试剂盒提取总rna，提取方法按着trizol使用说明书进行。所获得的总rna，利用primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒进行基因组dna去除并反转录(按试剂盒操作手册操作)。以反转录得到的第一链cdna作为模板，用于pcr扩增目的基因；

正向引物tflf1：5’-ctctggtcagtacgggcgggtcgat-3’(seqidno.7)；

反向引物tflr1：5’-gaaaataaaagtcctaaattgaattg-3’(seqidno.8)。

pcr反应体系为50μl：200ng上述cdna，1×phusionhf反应缓冲液，10mmdntps，2uhigh-fidelitydnapolymerase，上述引物各1μm，其余为水。扩增程序：98℃，5秒；98℃，30秒，60℃，30秒，72℃，2分钟，35个循环；72℃延伸2分钟。扩增得到pcr条带(图2)，将该基因命名为tfl。

3.pcr条带经1％(g/ml)的琼脂糖凝胶电泳分离，用qiaquickgelextractionkit回收多肉植物的pcr扩增条带，提取步骤参照试剂盒使用说明。回收纯化的dna片段与pmd18t克隆载体连接，连接操作步骤按照pmd18t载体的说明书进行。

连接产物利用热激法转化大肠杆菌dh5a，在含有50mg/l氨苄青霉素的lb固体培养基中筛选阳性克隆。挑单菌落进行菌液pcr验证，pcr扩增得到阳性转化子，如图3所示。挑取2个克隆测序，测序结果表明此tfl基因序列长度为500bp，其核苷酸序列与seqidno.4所示序列完全相同，由此证明多肉植物赫斯塔中具有该基因。

实施例2基因race反应扩增及基因全长获得

1.根据实施例1中所获得的seqidno.4所示基因片段信息，设计3’-race、5’-race基因特异引物。以实施例1中获得的赫斯塔花蕾总rna为模板，按着race5’/3’kit试剂盒说明书完成3’race和5’race的各项试剂混合和操作后，最终按照实施例1的操作步骤进行pcr扩增，扩增结果如图4、图6所示；回收和纯化pcr产物；将纯化产物与pmd18t载体连接，转化感受态细胞；筛选并阳性克隆，对插入基因进行pcr验证，如图5、图7所示，获得基因正确插入的阳性克隆进行测序。测序结果表明3’-race片段260bp，其核苷酸序列为seqidno.5所示；5’-race片段251bp，其核苷酸序列为seqidno.6所示。

3’race基因特异引物：5’-gatcagtcagcttatatgggac-3’(seqidno.9)；

5’race基因特异引物：5’-caaccaaccatgcgcgagt-3’(seqidno.10)。

反向引物为race5’/3’kit中提供的特异引物。

2.将实施例1和上述步骤中所获得基因片段序列进行拼接，获得完整的tfl基因序列。根据此完整序列，设计上下游引物，以实施例1中获得的赫斯塔花蕾总rna为模板，反转录获得cdna第一链，按照实施例1的操作步骤进行pcr扩增，扩增结果如图8所示；回收和纯化pcr产物；将纯化产物与pmd18t载体连接，转化感受态细胞；筛选并阳性克隆，对插入基因进行pcr验证，如图9所示获得基因正确插入的阳性克隆进行测序。获得测序序列进行分析，获得完整的tfl基因信息。测序结果表明tfl基因序列为723bp，其核苷酸序列为seqidno.1所示。5'端非翻译区(5'utr)长27个碱基，3'端非翻译区(3'utr)长42个碱基。tfl基因编码区为642bp，其核苷酸序列为seqidno.2所示；编码213个氨基酸，氨基酸序列为seqidno.3所示。

用于完整tfl序列扩增引物：

正向引物tflf2：5’-atacaatgaattttgccactgattat-3’(seqidno.11)；

反向引物tflr2：5’-ttttatattaaacgattcctttatg-3’(seqidno.12)。

实施例3多肉植物赫斯塔基因tfl同源性比对分析

将测序得到的完整基因序列(seqidno.1)在ncbi网站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)通过nucleotideblast进行基因同源性比对分析，发现其与花生(arachishypogaea)蛋白motherofftandtfl1-like基因mrna序列的359到606位具有79％的相似性，如图11所示，所以本发明中将该基因命名为tfl。

二、转tfl多肉植物的开花情况

实施例4转基因多肉植物的获得

1.利用实施例2获得的完整tfl基因构建重组表达载体ptf101.1-tfl，酶切位点xbaⅰ、ascⅰ，将重组表达载体转化根癌农杆菌eha101的感受态细胞，在含有50mg/l卡那霉素的yep固体培养基中筛选阳性克隆。挑单菌落进行菌液pcr验证，pcr扩增得到阳性转化子，如图10所示。

将上述重组农杆菌转化多肉植物中，转化流程参考文献“运用荧光基因转殖多肉植物百合属-玉露(haworthiaobtusavar.pilifera)之研究”，分别获得拟石莲花属多肉植物赫斯塔、群月冠、探戈、大红袍和翡翠波纹的转基因植株。

2.对转基因植株的开花期进行统计，每种选择5个植株，开花期的统计方法为多肉植物花序出现至出现第一朵花的天数，统计结果如表1所示。对所有植株进行正常水肥管理。

表1.5种不同拟石莲花属多肉植物的开花时间统计表

如表1所述结果显示，相比于未进行转基因的多肉植物植株个体，转入tfl基因的5种多肉植物，都出现了不同程度的开花期提前现象。从上述结果可知，tfl基因可以促进拟莲花属多肉植物开花。

当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围内。

序列表

<110>淄博苏夫人农业发展有限责任公司

<120>多肉植物开花调控蛋白tfl及其编码基因与应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>723

<212>dna

<213>赫斯塔(echeveriaherstal)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

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