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洋葱外植体的组织培养方法与对策

花匠小妙招
2025-01-04 02:07

引用本文

何林玉, 惠林冲, 陈微, 杨海峰, 李威亚, 缪美华, 陈振泰, 潘美红. 洋葱外植体的组织培养方法与对策[J]. 浙江农业科学, 2020,61(5):896-897
[J]. ZHEJIANG NONGYE KEXUE,2020,61(5): 896-897

doi: 10.16178/j.issn.0528-9017.20200527
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连云港市农业科学院蔬菜研究室,江苏连云港 222000

通信作者:潘美红,副研究员,研究方向为蔬菜育种、栽培与利用,E-mail : 7991454@163.com。

作者简介:何林玉(1994—),女,江苏东海人,研究方向为洋葱育种、栽培与分子生物学,E-mail:2419378318@qq.com。

基金项目:

江苏省自主创新项目(CX﹝17﹞2020)

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连云港市财政专项支持(QNJJ1806)

洋葱(Allium cepa L.)是百合科葱属2年生植物, 是重要的园艺蔬菜之一, 已有4 000多年的栽培历史, 在中国广泛栽培。洋葱选育周期长, 遗传背景复杂, 杂种优势明显。在洋葱杂交育种中, 对优良的不育系亲本材料进行扩繁, 需要利用组织培养的方法。本实验室目前只掌握了利用洋葱外植体进行愈伤诱导的方法, 再生体系还未建立。在洋葱组织培养中, 经常会出现污染现象, 浪费了大量的耗材和人力。所以本研究对洋葱外植体的组织培养方法进行研究, 以减低污染率, 为洋葱现代化分子辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 器材消毒与灭菌

镊子、超纯水、培养皿、1 mL枪头(放入组培瓶中)、手术刀、配套的滤纸(放入相对应的培养皿内)均用报纸包好, 放入灭菌锅内121 ℃高压灭菌20 min[1]。组培室开紫外灯30 min后关闭, 约20 min后进入组培室关闭超净工作台和室内的紫外灯。

1.2 培养基的制备

以MS为基础培养基, 加入1.8 mg· L-1 2, 4-D、30 g· L-1蔗糖、8 g· L-1琼脂, 调节pH为6.0~6.2, 编号为①。以MS为基础培养基, 加入8 g· L-1琼脂、30 g· L-1蔗糖, 调节pH为6.0~6.2, 编号为②。以MS为基础培养基, 加入1.0 mg· L-1 2, 4-D、1.0 mg· L-1 6-BA、30 g· L-1蔗糖、8 g· L-1琼脂, 调节pH为6.0~6.2, 编号为③。90 mm培养皿用报纸包好, 与培养基一同放入灭菌锅内121 ℃高压灭菌20 min。将2 mg· L-1甘氨酸、1 g· L-1酪蛋白水解物、690 mg· L-1脯氨酸溶于无菌水中[2], 在超净工作台内用0.22 μ m一次性过滤器过滤除菌后加入灭完菌的培养基①、③内, 充分摇匀后用90 mm培养皿进行分装, 每个培养皿约30 mL培养基。

1.3 洋葱外植体消毒

鳞茎盘消毒:选取无病虫害、球形较好的洋葱葱球, 剥去外表皮和肉质鳞片约2/3, 去掉底部须根, 注意勿伤及鳞茎盘及其生长点。自来水下冲洗约20 min, 放入工作台中消毒备用。在工作台内用75%乙醇表面消毒30 s, 无菌水冲洗1次, 有效氯为14%的次氯酸钠浸泡10 min, 无菌水冲洗3~4次, 无菌滤纸吸干表面水分[2]。

种子消毒:选取颗粒饱满的洋葱种子, 自来水下冲洗10 min, 超净工作台内用75%乙醇表面消毒30 s, 无菌水冲洗1次, 有效氯为2%的次氯酸钠浸泡10 min, 无菌水冲洗3~4次, 无菌滤纸吸干表面水分。因洋葱种子质量小, 易漂浮, 消毒过程中可来回轻微晃动, 使其充分与消毒液接触, 也可用无菌纱布套住消毒瓶口, 倒掉废液时防止种子随废液一起流出。

花苞消毒:选取无病虫害且未开的花苞, 留花梗约5 cm, 置于自来水下冲洗10 min, 在超净工作台内用75%乙醇表面消毒30 s, 无菌水冲洗1次, 有效氯为10%的次氯酸钠浸泡10 min, 无菌水冲洗3~4次, 无菌滤纸吸干表面水分。

花朵消毒:选取无病虫害且未开放的2.5~3.5 mm的花蕾[3], 留花柄约1.0 cm, 剪去其他部分, 自来水下冲洗20 min, 超净工作台内用70%乙醇表面消毒30 s, 无菌水冲洗1次, 有效氯为2%的次氯酸钠浸泡消毒15 min, 无菌水冲洗3~4次, 在无菌滤纸上晾干表面水分。

1.4 外植体接种培养基

晾干水分的鳞茎盘, 用无菌刀片切去与消毒液接触的表面, 取中间部分约5.0 mm× 5.0 mm× 2.5 mm的小块, 按照洋葱自然生长方向放置于培养基①内, 每皿约15个。放于(25± 2)℃黑暗条件下培养。约7 d后, 鳞茎盘开始长出愈伤, 约2周后愈伤长成; 在超净工作台内用无菌刀片切去老的鳞茎盘部分, 留新鲜愈伤, 放于新的培养基①内, 于(25± 2)℃黑暗培养[4]。

晾干水分的洋葱种子, 用无菌镊子正放于培养基②内, 每皿约25粒。放于(25± 2)℃的黑暗条件下培养, 约7 d后, 种子长出嫩芽, 超净工作台内用无菌刀片切去嫩芽, 将嫩芽、胚根整齐放于培养基①内, 于(25± 2)℃黑暗培养。

晾干水分的花苞, 用无菌刀片切去花蕾与花柄部分, 留花薹, 将花薹切成5 mm× 5 mm× 5 mm的正方体, 按照洋葱花薹自然生长方向正放于培养基①内, 约7 d后, 愈伤开始长出, 约2周后愈伤长成; 在超净工作台内用无菌刀片切去老的花薹, 留新鲜愈伤, 放置于新的培养基①内, (25± 2)℃黑暗培养。

晾干水分的花蕾, 用无菌刀片切去花柄与消毒液接触的表面部分, 留花柄约1 cm。将花柄轻插培养基③表面, 每皿约20个。放于光照下培养。

2 结果与分析

2.1 洋葱外植体接种培养基的污染率

洋葱外植体接种培养基2~3 d开始出现污染, 有真菌或细菌污染, 以真菌污染为主, 其中灰霉菌最多, 其次是绿霉菌。种子和花薹的污染主要为真菌污染(表1), 花薹污染率最低(30%), 种子污染率最高(达75%)。花蕾污染主要是细菌性污染, 尤其是培养后期细菌污染率更高。

表1 不同洋葱外植体愈伤诱导的污染率

2.2 洋葱外植体继代培养污染

在洋葱外植体继代培养中, 鳞茎盘、花薹在培养基上形成愈伤后, 继代培养的污染率在20%; 种子未形成愈伤, 未进行继代培养。花蕾在培养基中花苞开放, 雌蕊膨大, 由于花蕾单倍体培养周期长达3月, 后期转接污染率在70%。

2.3 洋葱愈伤组织中后期培养污染源位置

继代培养后, 由于操作过程中镊子、超净工作台灭菌不彻底, 操作者的手带菌等造成的污染, 培养基在3~5 d便会有真菌或细菌污染。洋葱组织培养中接种15 d以后开始有污染, 90%的污染源位置集中在培养皿的四周, 很少有污染源位置在培养皿中间(表2)。细菌性污染非常少, 主要为真菌污染, 且污染位置集中在外植体放置培养基位点周边空白处, 紧贴培养皿边, 多为继代培养15 d后出现污染, 说明污染源是外部传入, 培养基和愈伤组织均未带污染源。推测封口膜(parifilm)在培养过程中开口是导致污染的主要原因, 封口膜未进行消毒和灭菌(图1)。

表2 洋葱继代培养15 d后的污染源情况

3 小结

本实验选择的4种洋葱外植体, 以鳞茎盘和花薹愈伤组织诱导率最好, 高达100%, 而且鳞茎盘和花薹的污染率也较低。本研究发现, 继代培养后期由于封口膜漏气或破裂导致污染率较高, 由于封口膜无法高压灭菌, 故建议采用能够高压灭菌的塑料封口膜, 降低污染。在洋葱愈伤组织分化、生根诱导过程中, 我们进行了大量配方研究, 在分化培养基上可以诱导出大量的根, 在光照下根部有叶绿体出现, 但均未诱导发芽。后续还需对外植体基因型和诱导激素组合进行大量筛选, 以期诱导出洋葱苗, 建立稳定的再生体系。

(责任编辑:侯春晓)

参考文献:

[1]赵春莉, 李金英. 植物组织培养中污染原因及其控制方法[J]. 吉林农业科学, 2010, 35(6): 11-13.[本文引用:1][2]陈典, 徐启江. 分蘖洋葱茎尖愈伤组织诱导及植株再生[J]. 园艺学报, 2001, 28(4): 359-360.[本文引用:2][3]杜敏霞, 刘湘萍. 洋葱幼蕾离体培养与植株再生的研究[J]. 华北农学报, 2005, 20(4): 54-56.[本文引用:1][4]姜璐琰, 杨建平, 张松, 等. 洋葱组织培养研究进展[J]. 山东农业大学学报(自然科学版), 2003, 34(2): 201-204.[本文引用:1]