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一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法

花匠小妙招
2025-01-04 07:23

专利名称：一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法
技术领域：
本发明涉及一种通过组织培养技术的植物再生方法，特别是涉及一种以茎段为外植体的〗11芎组织培养快繁方法。
背景技术：
川芎为我国最常见的中药材之一，同时也是近几年国际市场的畅销植物药，是许多保健品和药品的重要原料。由于该药材受地理条件的限制，所以其栽种面积有限，主要分布在我国四川省都江堰。川芎为两年生植物，由于川芎植物结实困难，历来川芎的育种方法都是采用传统的茎节营养繁殖栽培，这种方法由于育种期间需要进行山区育苓、坝区栽种等环节，因此育种周期较长；另外，所采用的种芎种质资源"苓种"自身存在易衰老和易受病毒浸染等缺陷，因而造成川芎种性退化和品质下降，并易使种芎在生产和储藏中大量产生各种严重的病虫害。因此川芎的种质资源质量问题及育种时间长一直是困扰川芎大规模生产和提高产品质量的难题。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的育种时间长、种质资源不稳定、 "零种"自身易衰老和带菌等问题而提供一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，该方法可以大量快速地繁殖出生长速度快、品质优和染菌率低的川芎组培苗。
为达到上述目的，本发明采用的以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法包括如下步骤
(1)外植体的处理选取巳移栽到室内培养14天以上的川芎茎段作为外植体并进行表面消毒处理；
(2) 分化培养将消毒后的外植体接种于分化培养基上，在24 26。C，每天光照11 13小时、光照强度为1500 2000Lx进行培养，所述分化培养基是采用在Bs或MS中加入6-BA 1 3mg/L、 NAA0.1 0.5mg/L、蔗糖 30g/L和琼脂7.0g/L， PH值为5.8 6.5;
(3) 生根培养将所生长的芽切下转接到生根培养基上，在24 26。C、每天光照8 12小时、光照强度为1500 2000LX进行培养，所述生根培养基是采用在1/2MS中加入IBA0.1 0.5mg/L、蔗糖15g/L和琼脂7.0g/L， PH 值为5.8 6.5;
(4) 炼苗和移栽当每培苗长至2 3cm以上时，打开瓶盖，在室内炼苗2 4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部的培养基，将其移栽至松软的蛭石介质中。
上述方案中(l)步骤可采用的外植体消毒方法可以有很多，常用的消毒剂有70 75%乙醇、次氯酸钠溶液、二氯化汞溶液等，本发明优选的方法是先用洗衣粉浸泡外植体2 5分钟，再用流水冲洗2 3小时，然后在无菌条件下分别采用70 75%乙醇消毒20 30秒、0.1%升汞处理3 6分钟，最后用无菌水清洗3 4次。
上述方案中将芽转接到生根培养基前，先将芽在MS培养基中培养7 天以上，增加这样一个过渡过程，更有利于根的生长。
上述方案中，在将组培苗移栽至松软的蛭石介质后，应适当遮光，并保持温度在1S 22。C，相对湿度在75 85%，这样组培苗的生长更快、更健壮。
本发明方案中外植体可以是地上茎绿色茎段、地上茎紫色茎段、地下茎上部茎段或地下茎下部茎段，它们的分化率存在一k的差异，其中地上茎的紫色茎段腋芽分化率最高，地下茎的上部茎段分化率次之，但地下茎作为外植体进行繁殖时，除菌稍困难，因此川芎地上茎紫色茎段为最佳外植体。
本发明方法中最佳分化培养基为B5+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂7.0g/L，采用这种分化培养基进行分化培养时，腋芽的分化率最高，且苗生长速度快、健壮。
本发明方法中最佳生根培养基为1/2 MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，采用这种生根培养基进行生根培养时，生根率最高，且根分化速度快、根系发达及根粗壮。
本发明采用组织培养方法培养组培苗所花的时间与传统育种所花的时间相比大大縮短，而且培养的组培苗由于自身生长健壮，根系发达，因此不易感染病菌，克服了传统育种中不能利用种子繁殖、种质资源不稳定、育种时间长、"苓种"自身易衰老和带菌等问题。另外实施该方法只需有简单的植物组织培养设备即可进行，实用性强，且不受季节限制，因此能满足川芎大规模生产的需求。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式
实施例1
(1) 外植体的处理采集已移栽到室内培养H天以上的川芎地上茎的紫色茎段作为外植体，并对其进行消毒处理，所采用的消毒方法是先用洗衣粉浸泡2分钟，再用流水冲洗3小时，然后在无菌条件下分别采用浓
度为70%的乙醇消毒20秒、浓度为0.1%的升汞处理3分钟，最后用无菌
水清洗4次；
(2) 分化培养在超净工作台上将外植体切成l 2cm的长度，接种到腋芽的分化培养基B5+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L 上，并在24 26。C，每天光照12小时、光照强度为1500 2000Lx的条件下进行培养，培养3天后，茎段腋芽陆续开始萌发，生长速度最快，7天后腋芽分化率达到92.5%,且苗健壮，叶色浓绿；
(3) 生根培养当芽长到2cm左右时，将芽切下，在MS培养基中培养 7天后，转接到生根培养基1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L上，并在26 26。C、每天光照10小时、光照强度为1500 2000Lx的条件下进行生根培养，培养15天后无根苗(芽)茎节处开始生根，30天后统计生根率为95%，观察到无根苗生根速度快、根系发达且根粗壮，生根数在10条以上；
(4) 炼苗和移栽当组培苗长至3cm以上时，选择生长较健壮、具有绿叶片数较多和根系较发达的壮苗逐渐打开瓶盖，让幼苗慢慢地适应周围环境，在室内炼苗3天后，移栽至松软的蛭石介质中，适当遮光，温度保持在2(TC左右，相对湿度在75 85%，组培苗移栽的成活率可达100%。
实施例2
外植体采用已移栽到室内培养14天以上的川芎地上茎的绿色茎段，其它步骤与实施例1相同，7天后统计腋芽的分化率为62.5%。实施例3
外植体采用已移栽到室内培养14天以上的川芎地下茎的上部1/2茎段，其消毒方法是先用洗衣粉浸泡5分钟，再用流水冲洗2小时，然后在无菌条件下分别采用75%乙醇消毒30秒、0.1%升汞处理6分钟，最后用无菌水清洗3次。
其它步骤同实施例1， 7天后统计腋芽的分化率87.5%。实施例4
外植体采用已移栽到室内培养14天以上的川芎地下茎的下部l/2茎段，其它步骤同实施例3， 7天后，统计腋芽的分化率为81%。实施例5分化培养基采用MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 7.0g/L，其它步骤同实施例1。观察到无根苗生长较快，但苗没有实施例1 生长的壮。
实施例6
分化培养基采用B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 7.0g/L，其它步骤同实施例l。观察到腋芽的生长较缓慢，分化率为62.5%。实施例7
分化培养基采用B5+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 7.0g/L，其它步骤同实施例l。观察到腋芽生长快、苗健壮，叶色正常，分化率为85%。
实施例8
分化培养基采用B5+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 7.0g/L，其它步骤同实施例1。观察到腋芽生长快，但苗没有实施例1健壮。实施例9
生根培养基采用1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，其它步骤同实施例l。统计生根率为75%，观察到根的生长速度快，根系发达，生根数在IO条以上，但根没有实施例1的粗。
实施例10
生根培养基采用1/2MS+IBA0.3mg/L+蔗糖15g/L+琼脂7.0g/L，其它歩骤同实施例l，统计生根率为85%，观察到根的生长速度快，根系发达，生根数在10条以上，但根没有实施例1的粗。
权利要求
1.一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于它包括如下步骤(1)外植体的处理选取已移栽到室内培养14天以上的川芎茎段作为外植体，并进行表面消毒处理；(2)分化培养将消毒后的外植体接种于分化培养基上，在24～26℃、每天光照11～13小时、光照强度为1500～2000Lx进行培养，所述分化培养培养基是采用在B5或MS中加入6-BA 1～3mg/L、NAA 0.1～0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L，PH值为5.8～6.5；(3)生根培养将所生长的芽切下转接到生根培养基上，在24～26℃、每天光照8～12小时、光照强度为1500～2000LX进行培养，所述分化培养培养基是采用在1/2MS中加入IBA 0.1～0.5mg/L、蔗糖15g/L和琼脂7.0g/L，PH值为5.8～6.5；(4)炼苗和移栽当组培苗长至2～3cm以上时，打开瓶盖，在室内炼苗2～4天后，将组培苗从培养瓶中取出，洗掉根部的培养基，将其移栽至松软的蛭石介质中。
2. 根据权利要求1所述的一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于(1)步骤所采用的消毒方法是先用洗衣粉浸泡外植体2 5 分钟，再用流水冲洗2 3小时，然后在无菌条件下分别采用浓度为70 75% 的乙醇消毒20 30秒、浓度为0.1%的升汞处理3 6分钟，最后用无菌水清洗3 4次。 .
3. 根据权利要求1或2所述的一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于将芽转接到生根培养基前，先将芽在MS培养基中培养7天以上。
4. 根据权利要求1或2所述的一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于(4)步骤中将组培苗移栽至松软的蛭石介质后，适当遮光，并保持温度在18 22°C，相对湿度为75 85%。
5. 根据权利要求3所述的一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于(4)步骤中将组培苗移栽至松软的蛭石介质后，适当遮光，并保证温度在18 22°C，相对湿度为75 85%。
6. 根据权利要求1所述的一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于(1)步骤中外植体为已移栽到室内培养14天以上的川考地上茎的紫色茎段。
7. 根据权利要求1所述的一种以茎段为外植体的种川芎组织培养快繁方法，其特征在于(2)步骤中分化培养基为B5+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。
8. 根据权利要求1所述的一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，其特征在于(3)步骤中生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+ 琼月旨7.0g/L。
全文摘要
本发明公开了一种以茎段为外植体的川芎组织培养快繁方法，该方法包括外植体的处理、分化培养、生根培养、炼苗和移栽步骤，所采用的分化培养基为B<sub>5</sub>(或MS)+6-BA 1～3mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，所采用的生根培养基为1/2MS+IBA0.1+0.5mg/L。本发明方法可以大量快速繁殖出生长速度快、品质优、染菌率低的川芎组培苗，从而满足大规模生产川芎的需求。
文档编号A01H4/00GK101243775SQ20081004498
公开日2008年8月20日申请日期2008年3月14日优先权日2008年3月14日
发明者洁吴, 孙雁霞, 张海强, 徐作英, 徐文俊, 王跃华, 邬晓勇申请人:成都大学