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一种采用组织培养方法快速繁殖白及种苗的方法与流程

花匠小妙招
2025-01-10 10:39

本发明属于植物培养技术领域，具体涉及采用组织培养的方法对白及种子进行快速繁殖的方法。

背景技术：

白及[bletillastriata(thunb.exa.murray)rchb.f.]，为兰科(orchidaceae)白及属(bletillarchb.f.)多年生草本植物，分布于陕西南部、甘肃东南部、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川和贵州，生于海拔100-3200米的常绿阔叶林下，针叶林下、路边草丛或岩石缝中，假鳞茎扁球形，上面具荸荠似的环带，富粘性。假鳞茎入药名为白及，收录于《中国药典》，其性微寒，味苦、甘、涩，归肺、胃经，具收敛止血、消肿生肌之功效，主治烫灼伤、肺伤咳血、衄血、金疮出血、痈疽肿毒、溃疡疼痛、手足皱裂、肛裂等症。现代的药理研究表明白及假鳞茎浸出液具止血、保护胃粘膜、抗肿瘤和抗菌作用。现代医学研究发现，白及多糖可作生物材料，同时白及拥有良好的美白护肤作用，此外，白及花还可做花茶，具保健作用。因此对白及来说，一旦融入现代生产工艺中，白及的需要将会与日俱增。事实上，白及的价格连年攀升，由2000-2002年的13-14元/公斤，2007年升高到75-80元/公斤，2011年的200元/公斤，2017年已经达到800-950元/公斤。市场的巨大需求致使野生白及几乎被采挖殆尽，成为濒临灭绝的名贵中药材，被国家列为重点保护的野生药用植物之一，还被国际贸易公约(cites)附录二录入加以保护，所以如何高速人工种植是解决供不应求的关键。

以前在生产中白及的繁殖采用假鳞茎分株，长期的无性繁殖，不仅繁殖周期长，速度慢，而且需要的种源大，与药争夺原料，长期的无性繁殖易引起品种退化，土地连年耕作，假鳞茎积累大量病毒，严重影响产量和质量，因此无法满足规模化种植的需求。目前白及的组织培养被应用于快速繁殖上，组织培养具有培养条件可人为控制，生长周期短、繁殖率高、成本低廉、能够较好的保存母本性状、管理方便同、利于工厂化生产和自动化控制等优点在生产上越来越得到广泛的应用。

白及的组织培养的外植体主要采用的是种子，因为虽然白及种子的胚椭圆形，未分化，胚柄退化，无胚乳，自然状态下极少萌发。但在人工培养基下，其萌发率可以达到很高，而且白及一个果实中的种子数量可达到几万甚至十几万棵，通过无菌萌发就可达到很大规模，目前报道的文献(论文和专利)中普遍存在着从种子无菌播种到炼苗驯化时间需要超过5个月的问题，而且也存在着接入的种子和不定芽过少，从而造成组织培养成本居高不下的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供短时间、低成本、操作简便、高成活率，并利于实现产业化生产的组织培养方法快速繁殖白及种苗的方法。

为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：

一种采用组织培养方法快速繁殖白及种苗的方法，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)白及果实外植体的选择和消毒

于8-12月取白及果实，用70％-75％酒精擦拭表面后低温保存至少7天，实验前取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于均添加1滴吐温-80作为表面活性剂的0.1％hgcl2溶液或5％次氯酸钠溶液，10-120分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体；

(2)白及种子的无菌萌发

将上一步得到的果实放到湿润无菌滤纸上，横切去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子均匀撒在湿润无菌滤纸块上，用无菌镊子将撒好种子的湿润无菌滤纸块夹入培养基内平铺放好，培养基为添加了不大于10.0毫克/升的6-苄基腺嘌呤(6-ba)，不大于1.0毫克/升的α-萘乙酸(naa)，不大于1.0毫克/升的赤霉素(ga3)，不大于200克/升的香蕉泥的ms培养基，该培养基中的蔗糖添加量为30克/升，琼脂添加量为8.0克/升，ph为5.8-6.0，每瓶倾倒的培养基高度为1-3厘米，培养基曾于121℃下灭菌20分钟；每个果实的种子接种培养基5-100瓶，接好种子的培养基置先于黑暗中培养0-7天，培养温度为28±2℃；待种子由白色转为浅黄色后转入光照培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40μmol/(m2·s)；

(3)无菌苗的生根培养和假鳞茎诱导

将上一步培养25-30天后得到的无根苗(高度为3-5厘米)，用消毒镊子带滤纸一起夹出，在无菌培养皿内，用一把消毒镊子压住，用另一把消毒镊子拉开，接入到接种到添加有不大于5.0毫克/升的6-ba，不大于1.0毫克/升的naa，不大于1.0毫克/升的ga3，不大于200克/升的香蕉泥的1/2ms基本培养基中进行培养，该1/2ms基本培养基的大量元素、微量元素、有机物质和铁盐含量均为ms基本培养基的一半，肌醇不再添加，作为碳源的蔗糖添加量仍为30克/升，琼脂添加量为7.0-7.5克/升，ph为5.8-6.0，每瓶倾倒的培养基高度1-10厘米，每瓶接种0-200株无根苗，接完后转移到光照培养室内进行培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40μmol/(m2·s)；

(4)炼苗驯化

将上一步培养45-60天得到的生根白及苗，在假鳞茎直径超过0.5厘米后，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18小时，移走瓶盖，让30-40μmol/(m2·s)光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次，随后小心地将培养基捣碎，拿出组培苗，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，浸于70％甲基托布津200-3000倍液0-20分钟，取出后于阴凉处晾干0-120分钟，将植株定植于曾消毒过的营养土、菜园土、珍珠岩重量比为100：0-1000：1的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，5-10月在上面盖以75％的遮阳网，室内温度控制在20-28℃之间，当温度过高时喷雾降温，并保持通风；3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田。

作为优选方案，所述步骤(1)中选择选择无虫蛀和霉变的、由绿转黄但未变褐的果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存7天以上后作为外植体进行表面消毒，浸泡消毒时间为40-90分钟。

作为优选方案，所述步骤(2)中的ms培养基添加有6-ba1.0-3.0毫克/升，naa0.1-0.3毫克/升，ga30.1-0.2毫克/升，香蕉泥40-80克/升，每瓶培养基的种子接入量在500-1000颗为宜，且种子均匀平铺撒于湿润无菌滤纸片中再放入培养基上，接种3-4天种子开始萌发。

作为优选方案，所述步骤(3)中1/2ms培养基添加有6-ba0.2-0.5毫克/升，naa0.1-0.3毫克/升，ga30.1-0.2毫克/升，香蕉泥40-80克/升，1/2ms基本培养基中不添加肌醇，琼脂浓度7.0-7.5％，培养基厚度3-5厘米，每瓶培养基接入的无菌苗50-100棵，以达到最大利用效率。

作为优选方案，所述步骤(4)中的组培苗取出经清洗干净后，于70％甲基托布津800-1000倍液5-10分钟，取出后于阴凉处晾干20-30分钟，将植株定植于消毒过的营养土、菜园土、珍珠岩重量比为100：500-600：1的混合基质中。

作为优选方案，所述6-ba的浓度为2.0毫克/升，所述的naa的浓度为0.2毫克/升，所述ga3浓度为0.1毫克/升。

与现有技术相比较，本发明的有益效果是：

1.本发明能够缩短种子无菌萌发和生根培养时间，从而减少从种子无菌播种到炼苗的时间，中间只需转接一次且所用植物生长调节物质相同，方便操作，且种子萌发播入的种子数量和生根时可接入的不定芽数量均多于已有报道，可节省人力和耗材成本。

2.本发明从白及无菌播种到生根炼苗不到3个月，每瓶培养基播1000粒白及种子且种子萌发率可达98％以上，每瓶培养基可移入不定芽50-100个且生根率和假鳞茎诱导率接近100％，炼苗驯化成功率可达99％以上。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例1

一种采用组织培养方法快速繁殖白及种苗的方法，依次包括以下步骤：

(1)白及果实外植体的选择和消毒

于当年8-12月取白及果实，选择无虫蛀和霉变的、转黄到未变褐的果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存7天，实验前取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于0.1％hgcl2溶液或5％次氯酸钠溶液(均添加1滴吐温-80作为表面活性剂)40-90分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体；

(2)白及种子的无菌萌发

将上一步得到的果实放到湿润无菌滤纸上，横切去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子均匀撒在湿润无菌滤纸块上，尽量只有一层，用无菌镊子将撒好种子的湿润无菌滤纸块夹入培养基内平铺放好，培养基为添加了6-苄基腺嘌呤(6-ba)2.0毫克/升，α-萘乙酸(naa)0.2毫克/升，赤霉素ga30.2毫克/升，香蕉泥80克/升的ms培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30克/升，琼脂添加量为8.0克/升，ph为5.8-6.0，每瓶倾倒的培养基高度为1-3厘米，培养基曾于121℃下灭菌20分钟，下同；每个果实的种子接种培养基5-100瓶，接好种子的培养基置先于黑暗中培养3-4天，培养温度为28±2℃，此时发现种子开始由白色变成浅黄色，转入光照培养，7天全面转绿，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40μmol/(m2·s)，培养25-30天后，种子萌发率可达98％以上，苗的高度可达3-5厘米；

(3)无菌苗的生根培养和假鳞茎诱导

将上一步无根苗，用消毒镊子带滤纸一起夹出，在无菌培养皿内，用一把消毒镊子压住，用另一把消毒镊子拉开，每丛的株数尽量少，接入到接种到添加有6-ba0.5毫克/升，naa0.1毫克/升，ga30.1毫克/升，香蕉泥80克/升的1/2ms基本培养基中进行培养，该1/2ms基本培养基的大量元素、微量元素、有机物质和铁盐含量均为ms基本培养基的一半，肌醇不再添加，作为碳源的蔗糖添加量仍为30克/升，琼脂添加量为7.0-7.5克/升，ph为5.8-6.0，每瓶倾倒的培养基高度1-10厘米，每瓶接种50-100株无根苗，接完后转移到光照培养室内进行培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40μmol/(m2·s)，培养最早6天后，即可观察到不定芽的生根，15天起始最早观察到了假鳞茎的发生，待到培养45-60天时，假鳞茎直径可超过0.5厘米，而苗高8-10cm左右，此时生根率和假鳞茎的诱导率接近100％，随着时间的延续，假鳞茎会不断变大，最大可达1厘米左右，但叶片会变黄变枯；

(4)炼苗驯化

将生根白及苗，在假鳞茎直径超过0.5厘米后，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18小时，移走瓶盖，让30-40μmol/(m2·s)光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次，随后小心地将培养基捣碎，拿出组培苗，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，浸于70％甲基托布津800-1000倍液5-10分钟，取出后于阴凉处晾干20-30分钟，将植株定植于曾消毒过的营养土，菜园土，珍珠岩重量比为100：0-1000：1的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，5-10月在上面盖以75％的遮阳网，室内温度控制在20-28℃之间，当温度过高时喷雾降温，并保持通风。3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田，炼苗驯化率可达99％以上。

实施例2

本实施例与实施例1区别在于步骤(1)：白及果实外植体的选择与消毒：于当年8-12月取白及果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存，实验前取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于0.1％hgcl2溶液或5％次氯酸钠溶液(均添加1滴吐温-80作为表面活性剂)10-120分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体，表1中列出了浸泡于0.1％hgcl2溶液或5％次氯酸钠溶液(均添加1滴吐温-80作为表面活性剂)的不同消毒时间对种子污染率的影响：

表1不同消毒时间对白及果实消毒效果的影响

由表1可看出，随着消毒时间的延长，种子的污染率随之下降，下降幅度基本都是50％递减方式型，由0.1％hgcl2溶液消毒10分钟后56.67％的污染率，下降到0.1％hgcl2溶液消毒30分钟后3.67％的污染率，随后污染率均降为0，但消毒时间过久消毒液可能进入果实内部会对种子造成伤害，故选择40分钟-90分钟的消毒可确保完全消毒又对萌发无影响。另外，需要指出的是，果实里的种子是一种无菌的状态，影响污染率的是果荚附着的真菌休眠孢子。

表2列出了不同低温预处理时间对白及种子无菌萌发的影响：

表2不同低温预处理时间对白及种子无菌萌发的影响

由表2可知，随着低温预处理天数的延长，平均萌发所需的时间不断缩短，萌发率一直升高，直到7天后，萌发率已达100％。

另外对绿色，黄色和黑色果实的萌发实验表明，黄色果实的萌发率最高，其种子基本已经成熟，而且此时蒴果并未开裂，故果实的消毒并不会对内部的种子造成伤害，而颜色为黑色的果实其蒴果可能已经成熟开裂，浸泡消毒时消毒液进入其中，伤害到了种子，且影响了浸泡清洗残存消毒液的效果，导致种子的萌发率极低。

综合来看，采收黄色果实4℃冷藏于冰箱7天后的果实为最佳外植体，消毒40-90分钟为最佳消毒时间。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)：白及种子的无菌萌发：将上一步得到的果实放到湿润无菌滤纸上，横切去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子均匀撒在湿润无菌滤纸块上，尽量只有一层，用无菌镊子将撒好种子的湿润无菌滤纸块夹入培养基内平铺放好，培养基为添加了6-苄基腺嘌呤(6-ba)0-10.0毫克/升，α-萘乙酸(naa)0-1.0毫克/升，赤霉素ga30-1.0毫克/升，香蕉泥80克/升的ms培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30克/升，琼脂添加量为8.0克/升，ph为5.8-6.0，每瓶倾倒的培养基高度为1-3厘米，培养基曾于121℃下灭菌20分钟，下同。每个果实的种子接种培养基5-100瓶，接好种子的培养基置先于黑暗中培养0-7天，培养温度为28±2℃；待种子由白色转为浅黄色后转入光照培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40μmol/(m2·s)；表3列出了在ms培养基中添加不同植物生长调节剂及其配比对白及种子无菌萌发的影响试验：

表3植物生长调节剂配比对白及种子无菌萌发的影响

由表3可知，添加ga30.1毫克/升后不仅缩短了萌发所需的时间，而且也加快了出芽的速度，芽的长度明显变长，这可能与ga3破除休眠、促进种子萌发及促进完整茎段伸长的生理功能有关。

从表3还可以看出，6-ba2.0毫克/升、tdz0.5毫克/升的作用相关不大，2,4-d的作用要弱于naa，且添加了2,4-d的培养基，其种子虽见有萌发，但未见茎的生长，萌发的种子成球形，但并不伸长，而出现有很多的根毛状物质，随着时间的延续，这些根毛状物质缓慢伸长，随后球状体也变褐并枯死，而如果转移至无2,4-d的培养基中，过一段时间后，茎仍会伸长，但是明显比未受2,4-d处理的苗要慢，可能是2,4-d的效应消除需要一段时间。

本发明人通过实验还发现，使用无菌滤纸片，而非直接播撒于培养基，可以免除下一步转接取苗的困难；接入种子的量最多可平铺无菌滤纸，最多可至约1000粒种子，且实验中可观察到如果接入的种子太多，无法接触到滤纸的种子很少能发芽。

综合来看，添加6-ba2.0mg/l+naa0.2mg/l+ga30.1mg/l的ms培养基有着最佳的萌发效果，种子最好单层平铺于无菌滤纸上，最高可达1000粒种子。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)：无菌苗的生根培养和假鳞茎诱导：将上一步培养25-30天后得到的无根苗(高度为3-5厘米)，用消毒镊子带滤纸一起夹出，在无菌培养皿内，用一把消毒镊压住，用另一把消毒镊子拉开，每丛的株数尽量少，接入到接种到添加有6-ba0-5.0毫克/升，naa0-1.0毫克/升，ga30-1.0毫克/升，香蕉泥0-200克/升的1/2ms基本培养基中进行培养，该1/2ms基本培养基的大量元素、微量元素、有机物质和铁盐含量均为ms基本培养基的一半，肌醇不再添加，作为碳源的蔗糖添加量仍为30克/升，琼脂添加量为7.0-7.5克/升，ph为5.8-6.0，每瓶倾倒的培养基高度1-10厘米，每瓶接种0-200株无根苗，接完后转移到光照培养室内进行培养，培养条件为：培养温度为(28±2)℃，光照时间为14小时/天，光照强度30-40μmol/(m2·s)，表4列出在1/2ms基本培养基中添加不同植物生长调节剂及其配比对白及生根和假鳞茎诱导的影响试验：

表4植物生长调节剂配比对白及生根和假鳞茎诱导的影响

从表4可看出，降低ms浓度可提高生根率，减少养分可促进组培苗从异养到自养的转化；随着naa浓度的增加，生根率和假鳞茎诱导率随之升高，但过高naa对于植株的生长不利，表现为植物的茎和叶片发生水渍化；在添加生长素的同时，再添加6-ba和ga3可促进植株的生长，尤其是ga3的效果更明显，由于植株的生长，假鳞茎也随之增大。香蕉中含有丰富营养和生长质量，添加香蕉与不添加香蕉的区别是根系和叶片的生长。

添加的培养基的量对于苗的生长非常重要，过小的培养基会导致后期的营养跟不上，而过多的培养基会造成浪费，实验表明培养基高度在3-5厘米时，可保证50-100株组培苗的正常生长，这也是所有培养瓶空间可利用的组培苗数。综上所述，可看出1/2ms，naa0.1mg/l，6-ba0.5mg/l，ga30.1mg/l，香蕉80g/l是最佳培养基。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)：炼苗驯化：将上一步培养45-60天得到的生根白及苗，在假鳞茎直径超过0.5厘米后，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量无菌水以防止培养基干裂，于6小时后半挪开瓶盖，并添加无菌水，再过18小时，移走瓶盖，让30-40μmol/(m2·s)光强的灯光直照再生植株培养2天，期间加无菌水若干次，随后小心地将培养基捣碎，拿出组培苗，用流水小心将残留的琼脂冲洗干净，浸于70％甲基托布津200-3000倍液0-20分钟，取出后于阴凉处晾干0-120分钟，将植株定植于曾消毒过的营养土，菜园土，珍珠岩重量比为100：0-1000：1的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，5-10月在上面盖以75％的遮阳网，室内温度控制在20-28℃之间，当温度过高时喷雾降温，并保持通风。3天后揭开聚乙烯塑料薄膜四角，次日将聚乙烯塑料薄膜全部揭开，待新叶展开后即可带土移栽至大田，表1中列出了组培苗浸于70％甲基托布津200-3000倍液的时间以及混合基质配比对白及组培苗炼苗驯化的影响试验：

表5不同处理对白及组培苗炼苗驯化的影响

从表5可看出，组培生根苗如不经根部消毒而大面积种到基质中，在高温高湿的环境下，根部由于琼脂清洗可能不彻底的原因，发生大批污染，而经过70％甲基托布津处理后，污染大大降低，而成活率随之升高，稀释倍数越高，需要浸泡的时间越久，800倍液浸泡5分钟后，并晾干20分钟后就可以起到非常好的效果，过长的浸泡和晾干时间会对苗造成根部缺氧和叶片失水等问题。

进一步地，混合基质比例对于成活率有关系，主要在于基质不仅起着支撑作用，而且还起到了营养和通气的作用，只有在满足营养和通气均佳的条件下，成活率才可达到最高，单纯的营养土和单纯的菜园土少通性，得添加珍珠岩，在100：500：1的比例好于100：0：0和100：1000：1。

综合来看，800倍液浸泡10分钟，晾干20分钟，随后定植于消毒过的营养土，菜园土，珍珠岩重量比为100：500：1的混合基质中是最佳的炼苗驯化步骤。