野生白芨组织培养快速繁殖方法与流程
本发明涉及一种植物的培育繁殖方法，特别涉及药物的培育繁殖方法。
背景技术：
白芨Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.为兰科白芨属多年生草本植物，具有收敛止血、消肿生肌、治疗外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂及肺结核咳血、溃疡病出血等药用价值，同时还具有美容、美白、祛斑及观赏价值被广泛应用，其野生资源濒临灭绝。
白芨种子细小，似粉末状，没有胚乳，发育不完全的胚，不易发芽，很难进行种子繁殖；采用分株繁殖时，繁殖率低、繁殖速度慢。
技术实现要素：
本发明的目的旨在于克服现有技术的缺陷，提供一种通过组织培育进行繁殖，且繁殖率高、速度快的野生白芨组织培养快速繁殖方法。
本发明所述的野生白芨组织培养快速繁殖方法，其操作步骤为：
a.外植体材料及处理，取紫花白芨的假鳞茎，用小刀、牙刷处理表面杂物和泥土，置于饱和洗衣粉水溶液中浸泡10分钟，并充分摇晃后放于自来水下冲洗1-2小时，置于超净化工作台待处理；
b.将步骤a处理的假磷茎置于超净化工作台中用无菌水冲洗1次，75％乙醇消毒30s左右，无菌水冲洗1次；采用0.1-0.2％升汞消毒灭菌5-10分钟，无菌水冲洗3-4次，再将消毒处理后的假鳞茎切开，大小为0.5平方厘米，每块均带有芽眼，即得芽块；
c.将步骤b切好的芽块置于瓶装的诱导愈伤培养基中，每瓶培养基接种3-4块同，经过20-30天即可长出愈伤组织；
d.无菌苗分化，步骤c诱导的愈伤组织置于公化培养基中进行分化，用1/2MS+6-BA2.0-4.0+NAA0.1-0.2+蔗糖20％+琼脂8％+PVP0.5％+PH 5.8，原球茎分化出茎叶分化苗，28-30天的分化率达500—900％；
继代增殖，步骤d分化苗置于新的培养基中进行继代增殖培养，：MS+BA2.0+NAA0.2较适合，30天为一个周期，增殖倍数500％；
e.步骤d分化培养后，采用有机物促进茎叶分化，所采用的培养基是以MS为基本培养基，并加入1.0的6-BA和0.1的NAA以及7.5％的香蕉汁，既可以促进白芨球茎的生长，又可以促进白芨的生根，在光照条件下培养35-45天，苗高度约1.5-2.0cm并有叶片展开的白芨试管苗；
f.生根诱导培养，将步骤e的白芨试管苗转接到筛选出的生根诱导培养基中，每培养瓶接5-7株小苗，进行壮苗及诱根生长的培养，至平均根数达到3-6条；
g.缓苗：取生长健壮、根系3-5条、苗高10—15厘米的组培苗从培养室内移出到普通室内,避阳光直射，存放7-10天，然后再将瓶盖打开，在室内存放10—20天后将幼苗移出培养瓶；
h.炼苗：将幼苗根部的琼脂等培养苗全部洗去，将幼苗稍晾干(根系为白色)，放于0.1％的高锰酸钾溶液中消毒8-12分钟，炼苗过程中选择基质为蛭石：泥炭：珍珠岩＝1：2：1进行移栽，移栽苗存活率可以达到90％；
i.从白芨根段中分离到白芨真菌，初步鉴定为丝核菌属真菌，鉴定为白芨共生菌，通过拌菌移栽实验中，在蛭石：泥炭：珍珠岩＝1：2：1基质上，移栽存活率可达98％；
j.栽培技术：采用大棚和遮阳网相结合，紫花三叉白芨每亩栽培6000—12000株/亩，每亩需要400瓶以上的快繁白芨苗(每瓶有苗15株左右)，栽种2年，产量近2吨；
k.白芨苗的田间管理，白芨在田间管理除草要求严格，组培苗栽植后应适当用遮阳，避免阳光直射，同时注意浇水保湿，去除杂草，除草时浅锄，避免伤根；白芨喜阴，保持湿润，干旱时要浇水，7～9月份早晚各浇一次水；白芨又怕涝，大雨及时排水避免伤根；白芨是喜肥的植物，每个月喷施一次磷酸二氢钾或稀薄的人畜粪尿，10月以后，逐渐停止生长，进入休眠，但是要防止杂草丛生。
所述的诱导愈伤培养基，是以1/2MS为基本培养基，加入4.0的6-BA、0.2的NAA、0.5的PVP、糖20、琼脂8，PH5.8，经过20-30天即长出愈伤组织。
所述的生根诱导培养基，是以1/2MS为基本培养基，并加入1.0的NAA和0.1的6-BA，生根率为83.3％。
所述的生根诱导培养基，是以1/2MS为基本培养基，并加入1.0的NAA和75g/L的香蕉泥，生根率达100％。
本发明所述的野生白芨组织培养快速繁殖方法，采用紫花白芨的假鳞茎进行组织培育，经培养基培养后，其分化度率得到了较大的提高，可达到500％-900％，以适应快速扩大种源，经过缓苗、炼苗后移栽成活率达98％。本发明所述的培育方法简单、适用，成本低，不仅提高了组织培育的分化率，而且培育出的苗较为壮硕，移栽成活率高，一个月基本分化结束，经过诱根、缓苗、练苗，基本在65-80天即可完成育苗，大大缩短了白芨的培育繁殖时间，为野生白芨的训养提供了规模化种植的可能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于实施例。
实施例1
所述的野生白芨组织培养快速繁殖方法，其操作步骤为：
a.外植体材料及处理，取紫花白芨的假鳞茎，用小刀、牙刷处理表面杂物和泥土，置于饱和洗衣粉水溶液中浸泡10分钟，并充分摇晃后放于自来水下冲洗1-2小时，置于超净化工作台待处理；
b.将步骤a处理的假磷茎置于超净化工作台中用无菌水冲洗1次，75％乙醇消毒30s左右，无菌水冲洗1次；采用0.1-0.2％升汞消毒灭菌5-10分钟，无菌水冲洗3-4次，再将消毒处理后的假鳞茎切开，大小为0.5平方厘米，每块均带有芽眼，即得芽块；
c.将步骤b切好的芽块置于瓶装的诱导愈伤培养基中，每瓶培养基接种3-4块同，经过20-30天即可长出愈伤组织，诱导愈伤培养基，是以1/2MS为基本培养基，加入4.0的6-BA、0.2的NAA、0.5的PVP、糖20、琼脂8，PH＝5.8；
d.无菌苗分化，步骤c诱导的愈伤组织置于公化培养基中进行分化，用1/2MS+6-BA2.0-4.0+NAA0.1-0.2+蔗糖20％+琼脂8％+PVP0.5％+PH 5.8，原球茎分化出茎叶分化苗，28-30天的分化率达500—900％；
e.步骤d分化培养后，采用有机物促进茎叶分化，所采用的培养基是以MS为基本培养基，并加入1.0的6-BA和0.1的NAA以及7.5％的香蕉汁，既可以促进白芨球茎的生长，又可以促进白芨的生根，在光照条件下培养35-45天，苗高度约1.5-2.0cm并有叶片展开的白芨试管苗；
f.生根诱导培养，将步骤e的白芨试管苗转接到筛选出的生根诱导培养基中，每培养瓶接5-7株小苗，进行壮苗及诱根生长的培养，至平均根数达到3-6条，所述的生根诱导培养基，是以1/2MS为基本培养基，并加入1.0的NAA和0.1的6-BA，生根率为83.3％；
g.缓苗：取生长健壮、根系3-5条、苗高10—15厘米的组培苗从培养室内移出到普通室内,避阳光直射，存放7-10天，然后再将瓶盖打开，在室内存放10—20天后将幼苗移出培养瓶；
h.炼苗：将幼苗根部的琼脂等培养苗全部洗去，将幼苗稍晾干(根系为白色)，放于0.1％的高锰酸钾溶液中消毒8-12分钟，炼苗过程中选择基质为蛭石：泥炭：珍珠岩＝1：2：1进行移栽，移栽苗存活率可以达到90％；
i.从白芨根段中分离到白芨真菌，初步鉴定为丝核菌属真菌，鉴定为白芨共生菌，通过拌菌移栽实验中，在蛭石：泥炭：珍珠岩＝1：2：1基质上，移栽存活率可达98％；
j.栽培技术：采用大棚和遮阳网相结合，紫花三叉白芨每亩栽培6000—12000株/亩，每亩需要400瓶以上的快繁白芨苗(每瓶有苗15株左右)，栽种2年，产量近2吨；
k.白芨苗的田间管理，白芨在田间管理除草要求严格，组培苗栽植后应适当用遮阳，避免阳光直射，同时注意浇水保湿，去除杂草，除草时浅锄，避免伤根；白芨喜阴，保持湿润，干旱时要浇水，7～9月份早晚各浇一次水；白芨又怕涝，大雨及时排水避免伤根；白芨是喜肥的植物，每个月喷施一次磷酸二氢钾或稀薄的人畜粪尿，10月以后，逐渐停止生长，进入休眠，但是要防止杂草丛生。
实施例2
野生白芨组织培养快速繁殖方法，其操作步骤为：
a.外植体材料及处理，取紫花白芨的假鳞茎，用小刀、牙刷处理表面杂物和泥土，置于饱和洗衣粉水溶液中浸泡10分钟，并充分摇晃后放于自来水下冲洗1-2小时，置于超净化工作台待处理；
b.将步骤a处理的假磷茎置于超净化工作台中用无菌水冲洗1次，75％乙醇消毒30s左右，无菌水冲洗1次；采用0.1-0.2％升汞消毒灭菌5-10分钟，无菌水冲洗3-4次，再将消毒处理后的假鳞茎切开，大小为0.5平方厘米，每块均带有芽眼，即得芽块；
c.将步骤b切好的芽块置于瓶装的诱导愈伤培养基中，每瓶培养基接种3-4块同，经过20-30天即可长出愈伤组织，诱导愈伤培养基，是以1/2MS为基本培养基，加入4.0的6-BA、0.2的NAA、0.5的PVP、糖20、琼脂8，PH5.8；
d.无菌苗分化，步骤c诱导的愈伤组织置于公化培养基中进行分化，用1/2MS+6-BA2.0-4.0+NAA0.1-0.2+蔗糖20％+琼脂8％+PVP0.5％+PH 5.8，原球茎分化出茎叶分化苗，28-30天的分化率达500—900％，
继代增殖，步骤d分化苗置于新的培养基中进行继代增殖培养，：MS+BA2.0+NAA0.2较适合，30天为一个周期，增殖倍数500％；
e.步骤d分化培养后，采用有机物促进茎叶分化，所采用的培养基是以MS为基本培养基，并加入1.0的6-BA和0.1的NAA以及7.5％的香蕉汁，既可以促进白芨球茎的生长，又可以促进白芨的生根，在光照条件下培养35-45天，苗高度约1.5-2.0cm并有叶片展开的白芨试管苗；
f.生根诱导培养，将步骤e的白芨试管苗转接到筛选出的生根诱导培养基中，每培养瓶接5-7株小苗，进行壮苗及诱根生长的培养，至平均根数达到3-6条，所述的生根诱导培养基，是以1/2MS为基本培养基，并加入1.0的NAA和75g/L的香蕉泥，生根率达100％；
g.缓苗：取生长健壮、根系3-5条、苗高10—15厘米的组培苗从培养室内移出到普通室内,避阳光直射，存放7-10天，然后再将瓶盖打开，在室内存放10—20天后将幼苗移出培养瓶；
h.炼苗：将幼苗根部的琼脂等培养苗全部洗去，将幼苗稍晾干(根系为白色)，放于0.1％的高锰酸钾溶液中消毒8-12分钟，炼苗过程中选择基质为蛭石：泥炭：珍珠岩＝1：2：1进行移栽，移栽苗存活率可以达到90％；
i.从白芨根段中分离到白芨真菌，初步鉴定为丝核菌属真菌，鉴定为白芨共生菌，通过拌菌移栽实验中，在蛭石：泥炭：珍珠岩＝1：2：1基质上，移栽存活率可达98％；
j.栽培技术：采用大棚和遮阳网相结合，紫花三叉白芨每亩栽培6000—12000株/亩，每亩需要400瓶以上的快繁白芨苗(每瓶有苗15株左右)，栽种2年，产量近2吨；
k.白芨苗的田间管理，白芨在田间管理除草要求严格，组培苗栽植后应适当用遮阳，避免阳光直射，同时注意浇水保湿，去除杂草，除草时浅锄，避免伤根；白芨喜阴，保持湿润，干旱时要浇水，7～9月份早晚各浇一次水；白芨又怕涝，大雨及时排水避免伤根；白芨是喜肥的植物，每个月喷施一次磷酸二氢钾或稀薄的人畜粪尿，10月以后，逐渐停止生长，进入休眠，但是要防止杂草丛生。
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