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仙人掌果中三种酸性多糖的结构表征及其对Huh-7细胞过氧化氢诱导

花匠小妙招
2025-01-11 22:56

Introduction

仙人掌果作为一种天然来源的植物果实，富含蛋白质、氨基酸、维生素、多糖以及多酚等多种生物活性物质。其中，多糖作为一种低毒副作用的生物活性大分子而受到国内外学者的广泛关注。目前多糖研究主要集中在多糖的提取和分离纯化、一级结构表征、理化性质、生物活性及其作用机制等方面。

有研究表明，采用不同方法从植物组织的不同部位提取的多糖具有不同的结构性质，且提取技术上的差异也会导致多糖结构和生物活性的不同。目前，已有学者采用冷水浸提、热水浸提、热钙螯合剂提取等多种方法从仙人掌果的不同部位提取获得不同结构性质的多糖组分，但采用碱液从仙人掌果的果肉中提取得到具有较高生物活性的多糖组分尚未见文献研究，且多糖的结构与生物活性之间的构效关系仍需要深入研究阐明。

合肥工业大学陈寒青教授课题组以海南产的新鲜仙人掌果为原料，采用碱提、分级醇沉、柱层析分离从仙人掌果果肉中分离纯化得到三种不同分子质量的多糖组分，并对其结构进行了表征和抗氧化应激活性进行了研究，并阐明了其构效关系。研究结果为将仙人掌果开发成功能性食品提供了理论依据。

Results and Discussion

仙人掌果多糖的提取、分离纯化

以海南产仙人掌果鲜果为原料，将仙人掌果去皮、去籽、打浆之后，通过碱提、分级醇沉的方法得到3 种仙人掌果的粗多糖组分。经过AB-8大孔吸附树脂脱色和Sevag试剂脱蛋白处理后，利用DEAE-纤维素-52阴离子交换色谱柱和Sephacryl S-400凝胶渗透色谱柱进一步分离纯化得到3 种仙人掌果多糖组分OFPP-1、OFPP-2和OFPP-3，其分子质量分别为803.7、555.1 kDa和414.5 kDa。

仙人掌果多糖的单糖组成分析

通过气相色谱仪分析3 种仙人掌果多糖组分的单糖组成，如图1所示，3 种多糖组分的单糖组成和摩尔比有所不同。OFPP-1由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖组成，摩尔比为2.42:1.00:1.08:0.26:0.39；OFPP-2和OFPP-3由鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，摩尔比分别为11.73:1.00:2.35和1.09:1.00:0.30。

图1仙人掌果多糖的气相色谱图

仙人掌果多糖的高碘酸氧化

通过高碘酸氧化实验，判定了仙人掌果多糖组分OFPPs中糖苷键的可能类型。结果表明，仙人掌果多糖组分OFPP-1与高碘酸盐发生氧化还原反应，产生0.07 mol甲酸的同时需消耗0.23 mol高碘酸盐。甲酸的产生表明OFPP-1中1→或1→6糖苷键的存在。而OFPP-2和OFPP-3多糖组分在高碘酸氧化过程中，没有形成甲酸，说明不存在1→6糖苷键。

仙人掌果多糖的Smith降解

OFPPs的高碘酸盐氧化产物进一步进行Smith降解，得到的物质通过气相色谱分析。如图2所示，这3 种多糖组分的Smith降解产物中均含有甘油，表明糖残基可通过1→、1→2、1→2,6或1→6等糖苷键连接，而OFPP-1和OFPP-3的Smith降解过程中赤藓糖醇的产生则表明1→4或1→4,6等糖苷键的存在。此外，在OFPPs中均检测到少量未被完全氧化的单糖，表明Rhap、Araf和Galp等糖单元可通过1→3、1→2,3、1→3,6、1→3,4或1→2,3,4等糖苷键连接。

图2仙人掌果多糖Smith降解产物的气相色谱图

仙人掌果多糖的甲基化分析

通过甲基化分析阐明3 种仙人掌果多糖组分更加详细的糖苷键类型。如表1所示，OFPP-1主要由1,6-GalpA、1,2-Rhap和1,2,4-Rhap组成，少量的1,4-Glcp和1,3-Araf构成其侧链糖残基，而T-GalpA和T-Xylp则作为其末端糖残基存在。对于OFPP-2，1,4-GalpA、1,2-Rhap和1,2,4-Rhap糖残基构成其主链结构，末端糖残基T-Araf连接在1,2,4-Rhap的O-4位。同样地，在OFPP-3中也观察到大量糖残基1,4-GalpA、1,2-Rhap的存在。1,3-L-Araf和1,2,4-Rhap占比大致相同，说明1,3-LAraf可能作为侧链糖残基连接在1,2,4-Rhap的O-4位，而T-Araf作为末端糖残基连接在分支链的末端。值得注意的是，虽然这三个多糖组分来源相同，但它们在糖苷键连接和结构上有显著差异。

表1 仙人掌果多糖的甲基化分析结果

仙人掌果多糖的核磁共振光谱分析

经一维核磁（

H NMR、

C NMR和DEPT-135，见图3），二维核磁（COSY、HSQC、HMBC和NOESY光谱，见图4）对OFPPs进行结构分析。核磁共振光谱提供了有关碳水化合物结构的详细信息，包括α-或β-糖环构型、糖残基类型以及糖残基的连接方式等。将OFPPs中所有化学位移的分配总结在表2中，结果表明，OFPPs的结构特征是不完全相同的。

OFPPs的结构示意图如图5所示，OFPP-1的主链结构可能为→6-α-D-GalpA-(1→2)-α-LRhap-(1→。T-α-D-GalpA→6-α-D-GalpA-(1→4)-α-D-Glcp(1→、T-β-D-Xylp→6-α-D-GalpA-(1→4)-α-D-Glcp(1→或T-α-D-GalpA→3)-α-L-Araf-(1→作为其侧链存在，连接在Rhap残基的O-4位；OFPP-2的主链的重复单元为→2)-α-L-Rhap(1→4)-β-D-GalpA-(1→，T-β-L-Araf-(1→则作为分支糖残基连接在→2,4)-α-L-Rhap-(1→的O-4位；OFPP-3则可能是一种以→2,4)-α-L-Rhap-(1→2)-α-L-Rhap-(1→3)-β-L-Araf-(1→或→2,4)-α-L-Rhap-(1→2)-α-L-Rhap-(1→4)-β-D-GalpA-(1→作为主链结构，在→2,4)-α-L-Rhap-(1→的O-4位存在分支位点的多糖结构。

表2 仙人掌果多糖中糖残基的化学位移

图3仙人掌果多糖的

H NMR、13
C NMR和DEPT-135一维核磁图谱

图4仙人掌果多糖的COSY、HSQC、HMBC和NOESY图谱

图5仙人掌果多糖的结构示意图

OFPPs提高了H2O2处理的Huh-7细胞的活力

植物多糖通常具有高活性、低毒性的特点。从图6A-C可以看出，在质量浓度低于1 000 μg/mL时，OFPP-1和OFPP-2对Huh-7细胞没有明显的毒性，但在质量浓度高于200 μg/mL时，OFPP-3导致Huh-7细胞活力明显下降。因此，为了排除OFPPs对细胞活力的影响，本文选择50、100和200 µg/mL作为OFPPs的低、中、高剂量进行后续实验。

为选择诱导Huh-7细胞氧化应激的剂量，测定不同浓度H2O2对Huh-7细胞活力的影响，结果如图6D所示。孵育1 h后，当H2O2质量浓度大于等于1 000 μmol/L时，细胞活力显著降低。1 000 μmol/LH2O2处理可使细胞活力降低至76.67%，因此选择该浓度诱导Huh-7细胞氧化应激。

在上述条件下，不同剂量OFPPs对氧化应激下细胞活力的影响如图6E所示。1 000 μmol/L的H2O2处理使细胞活力降低到75.14%。然而，除了低剂量的OFPP-1外，NAC或OFPPs预处理对H2O2诱导的Huh-7细胞氧化应激损伤均具有保护作用。结果表明，OFPPs对H2O2诱导的Huh-7细胞氧化应激具有保护作用，提高细胞活力。

图6 仙人掌果多糖对Huh-7细胞活力的影响

OFPPs缓解了H2O2诱导的Huh-7细胞氧化应激

氧化应激是体内活性氧（ROS）和/或活性氮（RNS）的过量生成与抗氧化防御之间的不平衡状态。当体内存在大量ROS或少量抗氧化物质时，会对生物大分子如核酸、蛋白质等造成损伤。植物多糖，如从三七花中提取的多糖，由于其抗氧化活性而起到保护细胞免受氧化应激的作用。

丙二醛作为脂质过氧化产物，其含量通常被作为机体氧化应激的指标。如图7A所示，H2O2诱导使细胞产生更多的MDA (6.59 nmol/mg蛋白vs.1.38 nmol/mg蛋白)，而NAC或OFPPs预处理使细胞MDA含量显著降低。上述结果表明，OFPPs预处理可以减少脂质过氧化，从而改善细胞的氧化应激状态。

另一方面，提高细胞的抗氧化能力也可以降低氧化应激水平。H2O2诱导导致SOD、CAT、GSH-Px活性和T-GSH水平明显下降，而OFPPs预处理逆转了这一趋势(图7B-E)。这些抗氧化酶活性的增加和抗氧化蛋白含量的增加表明细胞抵抗ROS损伤的能力增强，从而减轻了Huh-7细胞的氧化应激。

图7仙人掌果多糖对H2O2处理的Huh-7细胞MDA、SOD、CAT、GSH-Px及T-GSH水平的影响

Conclusion

本文研究表明，3 种仙人掌果多糖组分均能有效减轻Huh-7细胞的氧化应激水平，且OFPP-2具有更显著的抗氧化活性。已有研究表明，多糖的生物活性与其结构密切相关，如分子质量、单糖的化学组成、糖苷键的类型等。分子质量较小的多糖通常具有较强的抗氧化能力。OFPP-2和OFPP-3的分子质量低于OFPP-1，这可能是OFPP-2和OFPP-3的抗氧化活性强于OFPP-1的原因。然而，分子质量并不是影响活性的唯一因素。鼠李糖的比例越高，OFPP-2的抗氧化能力也越强。因此，OFPPs特别是OFPP-2可能具有抗氧化活性的潜力，但其在体内的作用有待于进一步研究。

第一作者简介

刘瑞，女，合肥工业大学硕士研究生，主要研究方向为天然植物多糖的结构性质及生理活性。

通信作者简介

陈寒青，男，合肥工业大学教授、博士生导师，江南大学博士/博士后，美国普渡大学访问学者，中国食品科学技术学会高级会员，中国食品科学技术学会植物基食品分会理事，中国粮油学会食品分会常务理事，中国粮油学会薯类分会常务理事，安徽省营养学会常务理事。国家科技专家库评审专家，科技部科技创新领军人才通讯评审专家，国家自然科学基金食品科学学科同行评议专家，中国博士后基金食品科学与工程学科评审专家，国家留学基金评审专家，教育部科技评价与评审信息系统评审专家，教育部学位与研究生教育发展中心学位论文通讯评议专家，浙江省、江西省、河北省等省自然科学基金同行评议专家，安徽省科技项目评审专家，安徽省农委农业项目评估评审专家，安徽省粮食局省级粮食产业化专项资金评审专家。国际学术期刊Food Science and Human Wellness、Journal of Future Foods、Grain & Oil Science and Technology、Journal of Food and Nutrition Sciences和Journal of Pharmacy and Nutrition Sciences编委。Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety、Trends in Food Science and Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Food Chemistry、Food Hydrocolloids、Carbohydrate Polymers、Journal of Agricultural and Food Chemistry、ACS Sustainable Chemistry & Engineering、International Journal of Biological Macromolecules等40余种国际著名学术期刊审稿专家。2005年6月毕业于江南大学食品科学与工程专业，获博士学位。2007年9月-2009年11月在江南大学轻工技术与工程博士后科研流动站从事博士后研究工作。2016年9月至2017年9月国家公派美国普渡大学（Purdue University）农业与生物工程系/Whistler碳水化合物研究中心做访问学者研究。目前主要从事农产品精深加工及副产物综合利用、食品营养与功能因子、食品大分子（多糖、淀粉、蛋白质）结构性质与功能等方面的科研工作。近年来，主持了“十三五”国家重点研发计划项目子课题、国家自然科学基金面上项目（项目编号31171650、31972977）、安徽省科技重大专项项目（项目编号16030701079、202103a06020001）等10余项课题，共同主编《环糊精化学——制备与应用》科技专著1部，合作出版科技专著2部，授权国家发明专利14件，获教育部科技进步二等奖1项和中国石油和化学工业联合会科技进步二等奖1项，在Food Chemistry、Food Hydrocolloids、Carbohydrate Polymers等国际著名期刊发表SCI 收录论文80余篇，入选ESI高被引论文13篇，ESI热点论文4篇。发表的SCI收录论文被引用4900余次，其中单篇引用>100次有13篇，H-index为43（Google Scholar检索）。

Structural characterization of three acidic polysaccharides fromOpuntia dilleniiHaw. fruits and their protective effect against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in Huh-7 cells

Rui Liu, Fangxin Chu, Zheng Yan, Hanqing Chen

a,b,1

a,b

School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601, China

Engineering Research Center of Bio-Process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230601, China

These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authorseled Opuntia dillenii Haw. fruits by alkali-extraction, graded alcohol precipitation and column chromatography. Structural analysis indicated that OFPPs were pectic polysaccharides consisting of rhamnose, arabinose and galactose residues. The backbone of OFPP-1 consisted of a repeating unit →6-.

Abstract

Three novel acidic polysaccharide fractions (OFPP-1, OFPP-2, OFPP-3) with different m olecular weights (803.7, 555.1 and 414.5 kDa) were isolated from the pe--GalA-(1→2)---Rha-(1→ with T---GalA-(1→6)---GalA-(1→4)---Glc-(1→, T---Xyl-(1→6)---GalA-(1→4)---Glcp-(1→ or T---GalA-(1--Araf-(1→as the side chains. The backbone of OFPP-2 consisted of a disaccharide repeating unit →2)---Rhap-(1→4)---GalpA-(1→ with T--αDpαLpαDpαDpαDpβDpαDpαDαDp→3)-αLαLβDβL-Araf-(1→ as the branches substituted at the-4 position of →2,4)---Rhap-(1→. Whereas the backbone of OFPP-3 was →2,4)---Rhap-(1→2)---Rhap-(1→3)---Ara-(1→or →2,4)---Rha-(1→2)---Rha-(1→4)---GalA-(1→, which was branched at the O-4 position of→2,4)---Rhap-(1→. Moreover, these three polysaccharide fractions could protect Huh -7 cells against H2O2-induced oxidative stress to different extents by decreasing the MDA content and increasing the SOD, CAT, GSH-Px activities and the GSH level in the Huh-7 cells. These results suggest that OFPPs have the potential to be used as natural antioxidants.OαLαLαLβLfαLpαLpβDpαL

Reference:

LIU R, CHU F X, YAN Z, et al.Structural characterization of three acidic polysaccharides fromOpuntia dilleniiHaw. fruits and their protective effect against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in Huh-7 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 1929-1942. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250160.