一种农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法
本发明属于林木基因工程，具体涉及一种农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法。
背景技术：
1、沙棘(hippophae rhamnoides l.)，属胡颓子科沙棘属落叶多年生灌木或小乔木。沙棘生长快速、耐旱、耐盐碱、抗风沙，是水土保持和防沙治沙的重要生态木本粮油树种。沙棘是雌雄异株，有6个种13个亚种，其果实、叶和茎中富含多种对人体有益的、具较高营养和药用价值的生物活性成分，在食品、日化和医药等行业被广泛应用。
2、目前，沙棘分子生物学相关研究取得了较大进展，但关于沙棘遗传转化的研究鲜有报道，长期以来制约着沙棘基因工程研究的发展。因此探索沙棘转基因方法，提高功能基因转化的效率是沙棘基因工程及遗传育种研究中急需解决的主要问题之一。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，制备了携带pcambia-1300-mcherry表达载体的农杆菌转化液，建立沙棘高效浸花法转化体系，为沙棘功能基因组学研究提供技术支撑。
2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，步骤包括：
3、1.花枝选择：取长度40-60cm，无病虫害、授粉期间雌花饱满的沙棘枝条；
4、2.农杆菌的活化和培养：提取带有mcherry报告基因的质粒并转入农杆菌中，在含有链霉素、利福平和卡那霉素的yeb液体培养基中培养；
5、3.农杆菌转化液的制备：将培养好含有pcambia-1300-mcherry表达载体的农杆菌菌液离心后用缓冲液重悬菌体；
6、4.侵染沙棘植株：将含有花序的沙棘枝条在重悬菌液中浸染10-15分钟；20-24℃暗培养2-3天后正常培养，3个月后收集成熟果实；
7、5.mcherry荧光检测：使用luyor-3415rg手持式荧光观测仪进行观测；
8、6.mcherry表达量检测：提取果实总rna，使用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)分析mcherry基因的表达量变化情况。
9、进一步的，所述步骤1中沙棘枝条生长地为辽宁省旱地农林研究所。
10、进一步的，步骤2中所述的mcherry报告基因序列如seq id no.1所示。
11、进一步的，所述步骤2中使用冻融法将含有mcherry报告基因的载体pcambia-1300质粒转入lba4404农杆菌感受态细胞。
12、进一步的，所述步骤3中农杆菌转化液的od600值为0.8-1.0。
13、进一步的，所述步骤4中暗培养过程中隔1天使用重悬菌液再次侵染1次。
14、进一步的，所述步骤5中使用luv-590a荧光拍照滤镜(luyor)，用于红色荧光观察和拍照。
15、进一步的，所述步骤6中所述特异性引物的序列如seq id no.2-5所示。
16、本发明与现有技术相比的有益效果是：利用含mcherry报告基因的农杆菌lba4404菌液浸染沙棘授粉后雌花花序，获得转基因果实，不仅可以大大缩短转化周期，实验结果通过荧光观察也比较直观，且能够长期稳定表达，为沙棘基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，同时可以为培养转基因沙棘新品种奠定基础。
技术特征：
1.一种农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s1中沙棘枝条生长地为辽宁省旱地农林研究所。
3.根据权利要求1所述的农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s2中使用冻融法将含有mcherry报告基因的载体pcambia-1300质粒转入lba4404农杆菌感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s3中农杆菌转化液的od600值为0.8-1.0。
5.根据权利要求1所述的农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s4中暗培养过程中隔1天使用重悬菌液再次侵染1次。
6.根据权利要求1所述的农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s5中使用luv-590a荧光拍照滤镜。
7.根据权利要求1所述的农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法，其特征在于，所述步骤s6中所述特异性引物的序列如seq id no.2-5所示。
技术总结
本发明属于林木基因工程技术领域，公开了一种农杆菌介导浸花的沙棘遗传转化方法。包括花枝选择、农杆菌的活化和培养、农杆菌转化液的制备、侵染沙棘植株、mCherry荧光检测、mCherry表达量检测。利用含mCherry报告基因的农杆菌LBA4404菌液浸染沙棘授粉后雌花花序，获得转基因果实，不仅可以大大缩短转化周期，实验结果通过荧光观察也比较直观，且能够长期稳定表达，为沙棘基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，同时可以为培养转基因沙棘新品种奠定基础。
技术研发人员：阮成江,李景滨
受保护的技术使用者：大连民族大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17
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