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桂花品种鉴定的SNP标记组合、引物组合及分子身份证

花匠小妙招
2025-06-23 01:54

本发明涉及分子标记，具体而言，涉及桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合及分子身份证。

背景技术：

1、桂花(osmanthus fragrans lour.)隶属于木犀科(oleaceae)木犀属(osmanthus)，是一种观赏与实用价值兼备的木本经济树种，也是我国传统的十大名花之一，在中国的园林、花文化中有着重要的地位。在人工引种驯化的漫长过程中，桂花由天然野生至人工栽培，由南方向北方推进，应用范围日益扩大。通过种内变异的积累和与木犀属近缘种的杂交，桂花形成了丰富的种内变异和品种资源，目前已明确的品种数目约有160余个。然而，现有的桂花种质资源之间缺乏谱系关系的记载，且存在严重的同物异名和同名异物现象，既不利于标准化栽培技术的推广应用和品种优良特性的发挥，也不利于国际交流与贸易的正常开展。因此，建立一套经济、高效、准确的品种鉴别方法，是实现品种权保护与科学管理的重要前提，对于桂花产业发展具有重要意义。

2、近年来，植物品种资源鉴定技术已经从形态标记向高通量分子鉴定技术发展。dna指纹鉴定技术具有不受周围环境影响、快捷、准确和精准等优点，是植物新品种保护技术体系的重要组成部分。利用先进的生物技术和物联网等信息技术，建立品种dna身份信息数据库和全国统一查询平台，推行标签标识品种dna身份信息，能够实现品种身份快捷化、智能化查询。因此非常有必要在利用形态学方法鉴定品种纯度和真实性的同时，选择主流的高通量分型技术筛选核心引物，构建现有植物栽培品种的分子指纹图谱和数字指纹身份证，为后期进一步整合电子计算机技术的优势建立现有植物品种形态学数据和指纹图谱数据信息平台打下基础，实现植物品种快速检索和比对的功能。分子标记中具有共显性的特点的ssr和snp标记在稳定性和有效性上优势明显，被国际植物新品种保护联盟分子测试指南推荐作为指纹图谱数据库构建的首选标记。与ssr相比，snp标记为第三代分子标记，具有密度大、变异来源丰富、潜在数量巨大、适合数据库整合和数据共享、与功能基因甚至植物表型关联度高等优点。此外，随着各种snp高通量检测平台的出现，snp标记被公认是极具应用前景的分子标记技术，已在生物学、农业、医学和生物进化等领域得到了广泛应用。其中，lgc公司推出的kasp(kompetitive allele specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)技术，具有更加高效、灵活、准确、低成本的优势特点，在葡萄、甘蓝、玉米等作物的品种鉴定和品种保护工作中得到成功应用。

3、但是至今为止，snp标记和kasp基因组分型技术在桂花品种鉴定中的应用仍是空白，尚未有研究筛选出最少的snp位点组合来区分更多的主流桂花品种，并构建桂花品种分子身份证或条形码，以达到高效、准确、经济的鉴定目的。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合及分子身份证以通过尽可能少的snp标记组合构建特异单倍型，实现桂花品种高效、准确、经济的鉴定。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种桂花品种鉴定的snp标记组合，snp标记组合包括14个snp标记，14个snp标记分别为snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9、snp10、snp11、snp12、snp13和snp14，

4、snp1标记位于桂花1号染色体，其在桂花全基因组序列第2570938位的碱基为g或a；

5、snp2标记位于桂花2号染色体，其在桂花全基因组序列第27947738位的碱基为c或t；

6、snp3标记位于桂花3号染色体，其在桂花全基因组序列第24737420位的碱基为g或a；

7、snp4标记位于桂花6号染色体，其在桂花全基因组序列第3953530位的碱基为g或a；

8、snp5标记位于桂花7号染色体，其在桂花全基因组序列第4581291位的碱基为c或g；

9、snp6标记位于桂花9号染色体，其在桂花全基因组序列第11920715位的碱基为g或a；

10、snp7标记位于桂花11号染色体，其在桂花全基因组序列第7705120位的碱基为c或t；

11、snp8标记位于桂花13号染色体，其在桂花全基因组序列第24914140位的碱基为a或c；

12、snp9标记位于桂花14号染色体，其在桂花全基因组序列第1455309位的碱基为c或t；

13、snp10标记位于桂花15号染色体，其在桂花全基因组序列第27882455位的碱基为t或a；

14、snp11标记位于桂花18号染色体，其在桂花全基因组序列第26280736位的碱基为g或t；

15、snp12标记位于桂花23号染色体，其在桂花全基因组序列第10404919位的碱基为a或c；

16、snp13标记位于桂花23号染色体，其在桂花全基因组序列第17820664位的碱基为c或t；

17、snp14标记位于桂花23号染色体，其在桂花全基因组序列第20338374位的碱基为t或g；

18、snp的物理位置是基于桂花“日香桂”(genbank no.prjna529305)的全基因组序列确定。

19、上述snp标记组合是发明人基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出的14个桂花核心snp标记设计得到，利用该套标记引物组合进行kasp分型，分型结果稳定准确，鉴定效率高，可完全区分涵盖四个品种群的89个桂花品种。

20、在一种可选的实施方式中，桂花的品种包括如下品种群中的至少2个：四季桂品种群、金桂品种群、银桂品种群和丹桂品种群。例如包括四季桂品种群、金桂品种群和银桂品种群。

21、在一种可选的实施方式中，四季桂品种群包括9个品种、金桂品种群包括29个品种、银桂品种群包括28个品种、丹桂品种群包括23个品种。

22、四季桂品种群包括：橙黄四季桂、淡妆、墨宝香、日香桂黄、日香桂、四季桂(齿叶四季桂)、天女散花、天香台阁和圆叶四季桂；

23、金桂品种群包括：编金桂、长瓣金桂、长柄金桂、丛中笑、大花金桂、大叶黄、大叶金桂、芙蓉桂、杭州黄、黑珍珠、金桂河边、金球桂、金秋早、金狮桂、镰叶金桂、柳叶黄、柳叶金桂、柳叶苏桂、漓锗金桂、球桂、软叶金桂、山茶金桂、速生金桂、小花金桂、湘金、小叶金桂、圆瓣金桂、柱冠金桂和早秋红；

24、银桂品种群包括：白洁、波叶银桂、柴桂、长叶碧珠、串银球、长叶银桂、大叶银桂、宽叶籽银、绿梗籽银、柳叶桂、密结银桂、青尖、速生银桂、晚银桂、尾叶银桂、秀丽银桂、香云、小叶苏桂、玉帘碧珠、玉玲珑、玉帘银丝、杨梅叶银桂、银星、银盏碧珠、玉柱、中华龙桂、籽银桂和早银桂；

25、丹桂品种群包括：齿丹桂、橙红丹桂、橙香丹桂、鄂橙、红桂、火炼金丹、娇容、莲籽丹桂、满条红、平脉丹桂、软叶丹桂、上海丹桂、桃叶丹桂、晚霞、武夷丹桂、雄黄桂、象山丹桂、小叶丹桂、堰虹桂、硬叶丹桂、醉肌红、朱砂丹桂和状元红。

26、第二方面，本发明还提供了检测上述的桂花品种鉴定的snp标记组合的引物组合，14个snp标记组合标记snp1、snp2、snp3、snp4、snp5、snp6、snp7、snp8、snp9、snp10、snp11、snp12、snp13和snp14分别依次通过以下引物扩增得到：seq id no:1–3，seq id no:4–6，seq id no:7–9，seq id no:10–12，seq id no:13–15，seq id no:16–18，seq idno:19–21，seq id no:22–24，seq id no:25–27，seq id no:28–30，seq id no:31–33，seq id no:34–36，seq id no:37–39，seq id no:40–42。

27、上述每组检测snp标记的引物组合都包括两个正向pcr引物，和一个反向pcr引物。通过这三个引物配合荧光pcr实现该snp位点的可能基因型的确认，从而对品种进行鉴定。

28、在一种可选的实施方式中，引物组合为kasp引物组合。

29、第三方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包括上述的引物组合；

30、在一种可选的实施方式中，试剂盒还包括pcr buffer。

31、在一种可选的实施方式中，上述试剂盒还包括探针，在探针的5’端标记有荧光基团，在探针的3’端标记有猝灭基团。

32、第四方面，本发明还提供了一种构建桂花品种分子身份证的方法，包括以下步骤：

33、s1，采用重测序技术对目标桂花品种的桂花基因组dna进行测序，筛选出核心snp位点；

34、s2，根据筛选出的核心snp位点设计合成kasp引物组合，用设计出的kasp引物组合进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测；

35、s3，根据检测结果挑选核心kasp标记，采用r语言脚本从中筛选出能鉴定所有品种的snp标记组合；然后根据筛选出的snp标记组合进行桂花品种分子身份证的构建。

36、在本发明应用较佳的实施方式中，上述目标桂花的品种包括如下品种群中的至少2个：四季桂品种群、金桂品种群、银桂品种群和丹桂品种群；

37、在一种可选的实施方式中，四季桂品种群包括9个品种、金桂品种群包括29个品种、银桂品种群包括28个品种、丹桂品种群包括23个品种；

38、四季桂品种群包括：橙黄四季桂、淡妆、墨宝香、日香桂黄、日香桂、四季桂(齿叶四季桂)、天女散花、天香台阁和圆叶四季桂；

39、金桂品种群包括：编金桂、长瓣金桂、长柄金桂、丛中笑、大花金桂、大叶黄、大叶金桂、芙蓉桂、杭州黄、黑珍珠、金桂河边、金球桂、金秋早、金狮桂、镰叶金桂、柳叶黄、柳叶金桂、柳叶苏桂、漓锗金桂、球桂、软叶金桂、山茶金桂、速生金桂、小花金桂、湘金、小叶金桂、圆瓣金桂、柱冠金桂和早秋红；

40、银桂品种群包括：白洁、波叶银桂、柴桂、长叶碧珠、串银球、长叶银桂、大叶银桂、宽叶籽银、绿梗籽银、柳叶桂、密结银桂、青尖、速生银桂、晚银桂、尾叶银桂、秀丽银桂、香云、小叶苏桂、玉帘碧珠、玉玲珑、玉帘银丝、杨梅叶银桂、银星、银盏碧珠、玉柱、中华龙桂、籽银桂和早银桂；

41、丹桂品种群包括：齿丹桂、橙红丹桂、橙香丹桂、鄂橙、红桂、火炼金丹、娇容、莲籽丹桂、满条红、平脉丹桂、软叶丹桂、上海丹桂、桃叶丹桂、晚霞、武夷丹桂、雄黄桂、象山丹桂、小叶丹桂、堰虹桂、硬叶丹桂、醉肌红、朱砂丹桂和状元红。

42、在本发明应用较佳的实施方式中，上述步骤s1包括：

43、采用重测序技术对目标桂花品种进行测序，获得全基因组snp变异位点；对获得的全基因组范围的snp位点进行四次特异性筛选，得到核心snp位点。

44、在本发明应用较佳的实施方式中，上述四次特异性筛选包括：

45、(1)筛选出snp位点在89份桂花品种中基因型无缺失，次要等位基因频率maf>0.05的snp位点，完成第一次筛选；

46、(2)去除snp位点前后50bp有其他变异的snp位点，完成第二次筛选；

47、(3)筛选出多态信息含量(pic)在0.2–0.5之间的snp位点，完成第三次筛选；

48、(4)仅保留位于基因外显子区且在染色体上均匀分布的snp位点，完成第四次筛选。

49、在本发明应用较佳的实施方式中，上述s2步骤中，pcr扩增的反应条件包括：预变性95℃10min；梯度降温扩增95℃15s、55℃–61℃60s，10个循环(每循环减少0.6℃)；普通扩增95℃15s、55℃60s，30-32个循环；

50、在一种可选的实施方式中，s3步骤包括：

51、根据分型结果挑选出分型准确、在染色体上均匀分布的标记作为核心标记；

52、然后使用r语言脚本，基于87个核心snp在测序的89份桂花品种的基因型数据，先“初筛”出能鉴别所有供试桂花品种的snp鉴定组合，再在“初筛”基础上“循环精简”snp鉴定组合中的snp，达到“去冗余”的目的，最终筛选出能鉴别全部参试桂花品种的最少snp数量的标记组合。

53、此外，本发明还提供了一种构建桂花品种指纹图谱的方法，包括以下步骤：

54、s1，采用重测序技术对目标桂花品种的桂花基因组dna进行测序，筛选出核心snp位点；

55、s2，根据筛选出的核心snp位点设计合成kasp引物组合，用设计出的kasp引物组合进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行检测；

56、s3，根据检测结果挑选核心kasp标记，采用r语言脚本从中筛选出能鉴定所有品种的snp标记组合。

57、第五方面，本发明还提供了一种桂花品种分子身份证，其由上述的构建桂花品种分子身份证的方法构建获得。利用该套snp标记组合构建桂花品种分子身份证，可有效提升桂花品种纯度和真实性的检测效率。同时，利用条码生成器对14个位点的桂花品种基因型进行了条码表述，为桂花品种身份快捷化、智能化查询提供了便利，也为新品种审定及特异性评价提供科学依据。

58、在一种可选的实施方式中，桂花品种分子身份证包括以一维码和二维码的形式表示的代表品种的分子指纹码；

59、在一种可选的实施方式中，桂花品种分子身份证还包括品种商品信息码；品种商品信息码包括品种群类别、产地和形态特征数据。

60、第六方面，本发明还提供了一种桂花品种鉴定的方法，包括以下步骤：

61、确定待测桂花的dna在上述的桂花品种鉴定的snp标记组合中14个snp位点的基因型，与上述的分子身份证中所有的桂花品种的基因型进行对比；

62、若待测样本的分子指纹码与的桂花分子身份证中任意一种桂花品种的分子指纹码比对结果完全一致，则继续通过株形、皮孔、花色、花香、果实等形态学特征进行比较；若一致，则待测桂花品种为或候选为该桂花品种；

63、若二者分子指纹码比对结果不一致，则与基因型近似品种进行形态学特征比较，若存在差异，则判定待测桂花为新品种；

64、在一种可选的实施方式中，将新品种添加进分子指纹码中。

65、第七方面，本发明还提供了如桂花品种鉴定的snp标记组合、引物组合或分子身份证在桂花分子辅助育种中的应用。

66、本发明具有以下有益效果：

67、本发明公开了一种桂花品种鉴定的snp标记组合，该标记组合基于生物信息学方法结合数理统计等科学算法挑选出14个桂花核心snp标记设计得到，利用该套标记引物组合进行kasp分型，分型结果稳定准确，鉴定效率高，可完全区分涵盖四个品种群的89个桂花品种。利用该套snp标记组合构建桂花品种分子身份证，可有效提升桂花品种纯度和真实性的检测效率。同时，利用条码生成器对14个位点的桂花品种基因型进行了条码表述，为桂花品种身份快捷化、智能化查询提供了便利，也为新品种审定及特异性评价提供科学依据。