首页 > 分享 > 【综述】新一代测序在中枢神经系统感染病原体检测中的应用

【综述】新一代测序在中枢神经系统感染病原体检测中的应用

花匠小妙招
2025-06-25 16:16

点击标题下「蓝色微信名」可快速关注作者：吕遐关鸿志吴红龙朱以诚

中枢神经系统(CNS)感染是神经科的一类常见疾病，由于临床实验室检测手段的限制，超过一半的CNS感染病例最终都无法明确诊断。目前临床应用最广泛的CNS感染病原体检测方法主要包括：脑脊液病原体形态学鉴定、外周血或脑脊液培养、脑脊液和血清的病原体抗体检测以及脑脊液的基因检测。各种方法均有其局限性，其中培养和病原体抗体检测的适用范围有限，对病毒而言尤为如此。曾有研究表明，仅1.9%的脑脊液病毒培养是阳性的，若不计肠道病毒和疱疹病毒感染，则不到0.1%[1,2]。基因检测通过分子生物学的方法检测脑脊液标本中是否存在病原体的核酸序列，以确诊CNS感染。作为一种分子诊断手段，基因检测为确定CNS感染的病原体提供了精准的结果，具有重大的意义。

一、新一代测序技术(next－generation sequencing, NGS)与病原体检测

(一)NGS的起源与特点

NGS是相对于第一代DNA测序技术而言的新型测序手段。1977年Frederick Sanger发明了双脱氧链终止法，使得基因测序成为可能。随着技术的革新，除了标准的Sanger测序法之外，自动测序仪、荧光标记末端、毛细管测序等新方法不断涌现，但其本质仍是基于Sanger法完成的测序，因此被统称为第一代测序技术。第一代测序技术取得了相当成功的临床应用，但存在一些缺点，如测序反应时间较长、同时测序的数量较少、每次反应测得的长度有限。为了解决这一问题，美国国立人类基因组研究所(the National Human Genome Research Institute，NHGRI)于2004年启动了一项基金项目[3]，NGS正源于此。NGS又被称为"高通量测序(high－throughput sequencing)"或"深度测序(deep sequencing)"，包括二代测序与三代测序，其中二代测序的流程一般包括：(1)样本收集与DNA提取；(2)生成模板链，通过桥式PCR或乳液PCR等方式建立DNA文库；(3)通过焦磷酸测序法、可逆终止子法、连接测序法等边合成边测序：(4)对得到的测序结果进行分析，拼接成所需的DNA信息。三代测序与二代测序的主要不同在于通过单分子测序代替建立DNA文库后再测序，以减少PCR过程中引入的测序误差。NGS最大的优势在于可以同时测定几百万甚至上亿条DNA或者RNA序列，大大加快了全基因组测序的速度，从而可以极大地降低单个碱基测序的成本。

(二)NGS在病原体检测中的临床应用

NGS在全基因组测序、转录组和基因表达调控、表观遗传学等方面均有广泛的应用。临床上，除了肿瘤预防研究、遗传疾病的无创产前诊断等方面，NGS在病毒相关的癌症、病毒的基因组变异、病毒的进化等微生物相关方面的研究上也有着其他基因学手段无法比拟的优势。

1．协助临床明确病原体：

目前临床常用于病原体检测的分子生物学方法主要是PCR法，仅可针对某种特定病原体进行检测。在临床表现未能提示特定病原体的情况下，PCR法难以应用，而NGS使得无靶向的病原体广泛筛查成为可能。Ni等[4]将NGS的方法应用于北京协和医院神经重症监护病房5例不明原因发热的患者，上述患者的临床常见病原体检测结果均为阴性，最终诊断了EB病毒和草绿色链球菌感染，所用时间不到3 d。

2．发现新的病原体：

PCR、DNA微阵列等基因检测方法都有赖于已知的生物基因序列，而NGS的无偏倚、随机的特性使其不仅可以检测基因组已知的病原体，更可以从头组装基因组未知的新型微生物，从而成为发现新病原体的绝佳方法。Yu等[5]、Swei等[6]于2012、2013年先后报道了一种和儿童急性腹泻相关的新型多瘤病毒，以及一种从美洲花蜱中分离得到的本雅病毒的基因组序列。2011年Yu等[7]通过NGS研究发现，中国农村地区流行的发热伴血小板减低综合征(SFTS)是由一种新型的布尼亚病毒引起的，这种病毒后来被命名为"SFTS布尼亚病毒"。

3．获得更多病原体信息：

对于PCR阴性的病例来说，NGS提供了另一种获得病原体信息的可能。一项基于81名泰国儿童的队列研究[8]比较了NGS和实时PCR用于儿童呼吸系统疾病的病原体检测的情况，结果显示，虽然NGS的敏感度受其测序深度影响而不如实时PCR，但NGS可以同时获得病原体病毒的具体类型和信息，而这一点是实时PCR无法实现的。

4．实现对病原体的定量研究：

Greninger等[9]在2009年利用NGS完成了对全球流行的流感病毒A，即H1N1的基因组分析，并且首次探索了病毒滴度和NGS深度之间的关系。Be等[10]进一步使用NGS测定了战争感染伤口的生物载量，将NGS从定性深入至定量研究。

这些研究报道表明，NGS在临床感染性疾病的诊断和新病原体的发现中已经取得了瞩目的成果，其高通量、低成本、可从头组装病原体的优势是其他基因检测方法无法替代的。

二、NGS在CNS感染中的应用

(一)NGS诊断CNS感染的研究现状

NGS技术应用于CNS的相关报道较少，以病例报道为主。以("next－generation sequencing"OR"high throughput sequencing")AND ("encephalitis"OR"meningitis"OR"meningoencephalitis"OR"CNS infection") 为检索条件在PUBMED数据库检索英文文章，共查找到91篇符合条件的文献(截至2015年11月30日)。除去其中综述类型的文章，检测标本限定为人的脑组织或脑脊液，共检索到20项研究，列举如表1。

(二)NGS在CNS感染中的应用优势

NGS在不明原因脑炎患者的病原体检测中优势明显。近2年来，尤其是2015年，NGS在不明原因脑炎的病因诊断当中起到了重要作用。2014年，Wilson等[20]报道了1名先天性免疫缺陷的14岁儿童，发热、头痛4个月后出现昏迷，常规检测方法，包括脑组织活体组织检查，均未发现病原体；而脑脊液NGS提示了钩端螺旋体感染，PCR和血清学测试均证实了这一结果，应用青霉素G治疗有效。2015年，国内Guan等[23]应用NGS对4例疑似病毒性脑炎患者的脑脊液进行了检测，2例检测出人疱疹病毒1型、1例检测出人疱疹病毒2型、1例检测出人类疱疹病毒3型，深度范围1.1%～35%，覆盖度范围12%～98%，唯一匹配度分别为99.55%、99.00%、99.57%、93.51%；同时对其中3例进行了PCR检测，验证了NGS的结果。Perlejewski等[24]亦报道了应用NGS确诊人疱疹病毒1型脑炎的病例。这些研究提示，对于常见的CNS疱疹病毒感染，脑脊液NGS具有重要的确诊价值。

NGS可发现感染CNS的新型病原体，且以已知病毒的新病毒株为主。NGS技术可"从头组装"基因组，其无偏移特性可以发现传统病原学检测方法无法发现的、完全新颖的微生物，或者挖掘出某种已知微生物的未知致病能力[31]。例如2015年Hoffmann等[22]发现，3例具有类似动物接触史的脑炎死亡患者，常规病原体检测为阴性，通过NGS发现病原体为一种新型博尔纳病毒。最近日本一项研究[32]在4例表现为进展性痴呆患者的颅内血管周围发现一种未知的微生物。通过NGS方法，显示这种病原体的基因序列与古细菌相似。在此之前，医学界认为古细菌不会引起人类疾病，而这一发现则更新了我们对于古细菌的认识。

(三)面临的问题与局限性

作为一种新的病原体诊断技术，脑脊液NGS的结果分析与判读尚无统一的标准。与血清学、PCR等针对某种特定病原体的检测方法不同，脑脊液NGS通常会获得多种疑似病原体基因序列，将这些序列与病原体基因组进行匹配与分析才能获得诊断信息。标本取材与实验室检测中可能污染和混入微生物基因序列是难免的，污染的测序作为背景"噪声"可能会明显影响结果的判断。理论上，某种病原体相对应的覆盖度与深度越高，提示标本中存在该病原体的可能性越大。对于NGS筛查到的高度疑似的病原体，进行进一步的确认实验是必要的。包括PCR检测、特异性血清学检测、病理学方法，例如免疫细胞化学和原位杂交方法等。

用于结果分析的病原体基因组数据库需要做到本地化，不断根据临床需要，特别是CNS感染的病因体谱系进行扩充与调整。例如，在我国猪绦虫和曼氏裂头蚴是较常见的CNS寄生虫感染类型，但是目前尚没有这两种寄生虫的全基因组数据。在获得其全基因组数据前，只能将已知的部分基因序列加入数据库中用于比对，这可能会降低检测的敏感度。

三、总结

综上所述，NGS作为一种较新的测序手段，理论上不仅可以快速筛查所有可能的病原体，也可以发现新的未知的致病微生物，为提高CNS感染的诊断率和病原体研究提供了可能。尽管国内外已经有报道应用NGS技术成功发现CNS感染的病原体，但其临床应用的推广仍然有限。技术上的主要难点包括NGS本身的生物信息学挑战、测序平台的提高，以及CNS给标本处理带来的特殊性。NGS对于临床治疗方向的指导意义，如阳性结果的判定、阴性病例的诊断价值等，仍有赖于更大样本的研究。

参考文献略