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一种剑叶龙血树愈伤组织成苗的方法与流程

花匠小妙招
2025-11-04 12:03

本发明涉及苗木无性繁殖技术领域，特别涉及一种剑叶龙血树愈伤组织成苗的方法。

背景技术：

剑叶龙血树(dracaenacochinchinensis(lour.)s.c.chen)为百合科龙血树属，又名千年木、血竭树、交趾龙血树，其性味甘，温，咸平，有活血化瘀，消肿止痛，收敛止血之功效，主要用于跌打损伤，金疮出血及心腹绞痛等，属国家重点保护野生植物，濒危稀有物种。剑叶龙血树具有很高的药用价值，为我国传统名贵中药材。。我国剑叶龙血树资源越来越少，中药资源用量急剧上升，近年来，市场对龙血竭与是俱增，从而导致人们对剑叶龙血树野生资源毁灭性的采伐，濒危灭绝，已被很多国家列为珍稀濒危植物。

通过组织培养的方式进行繁殖，其繁殖速度快，苗木质量好，可达到规模化生产的目的。剑叶龙血树的组培条件比较苛刻，一般的培养组培条件很培养出剑叶龙血树或者培养出来的剑叶龙血树的褐化率极高。为此，剑叶龙血树的组织培养的难度在于：问题一，探索剑叶龙血树愈伤组织诱导的最佳激素因子和条件以此增加愈伤组织的诱导率；问题二，通过添加防褐化物质、改变培养环境等方式找到更佳的抑制褐化办法，以期有效降低褐化率，建立高质量的剑叶龙血树愈伤组织培养体系；问题三、探索剑叶龙血树愈伤组织的分化、生根培养的最佳激素因子和条件以此提高剑叶龙血树丛生芽增殖系数和生根率。目前利用组织培养技术繁殖剑叶龙血树的研究只有两篇对比文件，对比文件1：专利申请号为“cn201510755473.7”，专利名称为“一种剑叶龙血树疏松愈伤组织诱导的方法”解决是上述技术问题一；对比文件2：专利申请号为“cn201410735185.0”，专利名称为“一种剑叶龙血树愈伤组织诱导及防褐化的方法”，解决的是所述技术问题二；以上两篇对比文件均未探索及解决问题三中的后续剑叶龙血树愈伤组织的分化、生根培养的最佳激素因子和条件。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种剑叶龙血树愈伤组织成苗的方法，采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树丛生芽增殖系数达到5-12倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，生根率可达90％以上，移栽成活率在95％以上，可在短时间内可培育出大量适合栽培种植的剑叶龙血树幼苗，保障剑叶龙血树苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种剑叶龙血树愈伤组织成苗的方法，具体包括如下步骤：

步骤1、外植体的选择：取剑叶龙血树无菌试管苗作为外植体；

步骤2、培养基诱导获得愈伤组织：将外植体置于诱导培养基中诱导得到愈伤组织；

步骤3、愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于ms继代培养基中进行增殖培养获得大量愈伤组织；

步骤4、愈伤组织分化培养：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于ms分化培养基中进行分化培养获得大量丛芽，其中ms分化培养基中添加2.0mg/l的甲硫达嗪tdz、0.2mg/l的激动素kt、0.5mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8；

步骤5、生根培养：将步骤(4)中得到的丛芽分成单芽置于1/2ms生根培养基中培养得到完整带根苗，其中1/2ms生根培养基中添加1.0mg/l的萘乙酸naa、2g/l的活性炭、10g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8；

步骤6、炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗4-7天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的栽培基质中。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的一种剑叶龙血树愈伤组织成苗的方法，采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树丛生芽增殖系数达到5-12倍，生根率在90％以上，移栽成活率在95％以上，可在短时间内提供成活率高的剑叶龙血树优质种苗，有效解决剑叶龙血树的规模化育苗问题。

2、本发明愈伤组织分化培养是所用的ms分化培养基中添加了1-3mg/l的甲硫达嗪tdz、0.1-0.5mg/l的激动素kt、0.1-0.5mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp，其中适宜浓度的及配比的甲硫达嗪tdz、激动素kt以及芸苔素内脂可促进剑叶龙血树丛生芽大量增殖；聚乙烯吡咯烷酮pvp可有效防止褐化。

3、本发明使用的1/2ms生根培养基中添加了0.5-1.0mg/l的萘乙酸naa、2g/l的活性炭，适宜浓度的萘乙酸naa可提高剑叶龙血树生根率，活性炭用来吸附植物产生的某些有害的次生代谢产物,活性炭有减少褐化的作用。

具体实施方式

(一)剑叶龙血树牙增值培养的ms分化培养基中生长素配比的探索

实施例1

(1)外植体的选择：取剑叶龙血树无菌试管菌作为外植体。

(2)培养基诱导获得愈伤组织：得到的外植体置于超净工作台内，用解剖刀割0.5cm的段，接种到ms培养基中，在培养温度为23-27℃的暗培养的条件下培养40天得到大量愈伤组织，其中ms培养基中添加1.0mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、0.2mg/l的萘乙酸naa、1.0mg/l的二氯苯氧乙酸2.4-d、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。

(3)愈伤组织增殖培养：将步骤(2)中得到的愈伤组织置于ms培养基中，在培养温度23-27℃、光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养40天得到可分化的愈伤组织部，其中ms继代培养基中含1.0mg/l的甲硫达嗪tdz、0.5mg/l的二氯苯氧乙酸2.4-d、1.0mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其中，1.0mg/l的硫达嗪tdz的意思为在1l的ms培养基中添加1.0mg的硫达嗪tdz，其他物质的添加同理。

(4)愈伤组织分化培养：将步骤(3)中得到的愈伤组织置于ms分化培养基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到大量丛芽，其中ms分化培养基中添加3.0mg/l的甲硫达嗪tdz、0.5mg/l的激动素kt、0.3mg/l芸苔素内脂2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。

(5)生根培养：将步骤(4)中得到的丛芽分成单芽置于1/2ms生根培养基中在培养温度23-27℃、光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30天得到完整带根苗，其中1/2ms生根培养基中添加1.0mg/l的萘乙酸naa、2g/l的活性炭、10g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。

(6)炼苗移栽：将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗4-7天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到灭过菌的栽培基质中。

实施例2

步骤4中所用的ms分化培养基中添加2.0mg/l的甲硫达嗪tdz、0.2mg/l的激动素kt、0.5mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其他操作步骤均与所述实施例1相同。

实施例3

步骤4中所用的ms分化培养基中添加1.5mg/l的甲硫达嗪tdz、0.2mg/l的激动素kt、0.3mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其他操作步骤均与所述实施例1相同。

实施例4

步骤4中ms分化培养基中添加1.5mg/l的甲硫达嗪tdz、0.5mg/l的激动素kt、0.5mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其他操作步骤均与所述实施例1相同。

实施例5

步骤4中ms分化培养基中添加1mg/l的甲硫达嗪tdz、0.1mg/l的激动素

kt、0.1mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其他操作步骤均与所述实施例1相同。

实施例6

步骤4中ms分化培养基中添加3mg/l的甲硫达嗪tdz、0.5mg/l的激动素kt、0.5mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp、30g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其他操作步骤均与所述实施例1相同。

对比实施例1

与实施例1不同的是，步骤4中试管苗丛生芽快速繁殖培养时，所用的ms分化培养基为ms培养基基本成份，不添加别的成分。其他步骤与实施例1中相同。

以上实施例1-实施例6以及对比实施例1中均同时至少重复3次，分别观察并计算以上实施例1-实施例6中剑叶龙血树的的出芽繁殖倍数(即一个芽接进培养基里它能长出多少个芽来)并统计如下:

表1

由上表1可知，实施例1为最佳实施例，即ms分化培养基添加2.0mg/l的甲硫达嗪tdz、0.2mg/l的激动素kt、0.5mg/l芸苔素内脂、2mg/l聚乙烯吡咯烷酮pvp，出芽率最高。适宜浓度的及配比的甲硫达嗪tdz、激动素kt以及芸苔素内脂可促进剑叶龙血树丛生芽大量增殖；聚乙烯吡咯烷酮pvp可有效防止褐化。

(二)生根培养基中生长素配比探索

由上可知实施例1出芽率最高，因此设置实施例7，其中ms分化培养基与实施例1相同，不同的是步骤5中1/2ms生根培养基中添加0.5mg/l的萘乙酸naa、2g/l的活性炭、10g/l蔗糖和5g/l的琼脂，培养基的ph值为5.8。其他步骤均与所述实施例1相同。以此探索合适的配比提高剑叶龙血树的生根率。

对比实施例2：1/2ms生根培养基不添加其他成分。

以上实施例1、实施例7及对比实施例2中均同时至少重复3次，分别观察并计算以上实施例1和实施例7中剑叶龙血树的生根率并统计如下:

表2

由上表2可知，实施例1的生根率最高，即1.0mg/l的萘乙酸naa、2g/l的活性炭，适宜浓度的萘乙酸naa可提高剑叶龙血树生根率，活性炭用来吸附植物产生的某些有害的次生代谢产物,活性炭有减少褐化的作用。

(三)移栽情况的比对

下面对实施例1和对比实施例1得到的组培苗进行移栽情况对比。

将两种生根培养基的苗，培养20天后，同时将两种组培苗进行炼苗，获得带根的完整植株后，在室温为25°的室内打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到通风良好且弱光的沙土壤中，在沙土壤中生长一个月后移栽大田。将所述完整带根苗在室温为25℃的室内打开瓶盖，瓶内加30ml自来水，炼苗4-7天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基立即移栽到通风良好且弱光的沙土壤中，在沙土壤中生长一个月后移栽大田。移栽后一个星期内，每天早8点到晚6点喷雾3-5次，每次10min，此后每天早8点、晚6点各喷雾1次，每次10min；移栽时的温度条件为20-28℃，相对湿度75-80％，遮阳率为70％。移栽后，浇透定根水，而后每天早晚各淋水一次，移栽剑叶龙血树苗20天后，每隔七天喷施0.1％一0.3％磷酸二氢钾叶面肥，并且定时浇营养液。

每天观察记录，在移栽12天后，采用以下公式调查统计两种组培苗移栽成活率。

移栽成活率(％)＝(每处理移栽剑叶龙血树组培苗成活株(丛)数/每处理移栽剑叶龙血树组培苗总株(丛)数)x100％。

移栽成活率按照剑叶龙血树组培苗株高分为两种统计方法进行比较，即移栽前总苗成活率和5cm以上剑叶龙血树苗成活率，具体数据详见表3实施例1和对比实施例1的组培苗移栽情况。

表3

通过表3中的数据对比表明，结果表明：实施例1的剑叶龙血树组培苗移栽总成活率为95.0％，远远高于传统ms培养移栽成活率16.0％；另外，移栽后返青需要的天数，实施例1的早于对比实施例1的，这充分说明采用本发明的技术方案进行剑叶龙血树组织培养，剑叶龙血树苗的质量好，根吸收能力较强，移栽后适应环境能力强于传统ms培养，移栽后返青期早，易于成活。

综上所述，采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树丛生芽增殖系数达到5-12倍，生根率在90％以上，移栽成活率在95％以上，可在短时间内提供成活率高的剑叶龙血树优质种苗，有效解决剑叶龙血树的规模化育苗问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。