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五种食用花卉体外模拟消化过程中多酚、黄酮含量及抗氧化活性的变化

花匠小妙招
2024-11-02 02:36

可食用花卉是一种其花朵或花叶能够直接食用的植物类型[1]。我国可食用花卉资源丰富，达180多种，主要有菊花、百合、槐花、桂花、玫瑰花等，现已有2000多年的食用历史。食用花卉的应用方法丰富，可制成菜肴，入药或制茶。研究显示，食用花卉中含有多种氨基酸、矿物质、维生素、蛋白酶等人体必需营养物质，如，桂花中富含VA和VC，玫瑰中VC的含量是柠檬的50倍，黄花菜中VE含量高达4.95 mg/100 g，均可协助维持人体正常生理功能；红花中钙、镁、铁等矿物质含量颇多，对镇痛活血有突出贡献[2]。同时，可食用花卉中也含有多酚及黄酮等多种生物活性物质，其中部分活性成分具有较强的自由基清除能力，能减缓细胞老化，改善内脏环境，具有较好的抗氧化性能[3-4]，如桂花提取物具有较好的抗氧化和延缓衰老的作用[5]；万寿菊提取物可以有效地增强大鼠机体抗氧化能力，从而延缓D-半乳糖诱发的大鼠衰老[6]，其生物活性成分叶黄素对小鼠D-半乳糖氧化损伤模型抗氧化活性在1～25 mg/kg范围内显示出显著的降低小鼠血清MDA水平和升高SOD活性[7]；菊花提取物抗肿瘤细胞、抗氧化效果很高[8]，栀子花提取物[9]和木槿花提取物[10]经研究发现均具有较好的抗氧化性能。这些花卉在我国分布较广，日常容易获取且主要作为代用茶饮用，但其消化后多酚、黄酮及抗氧化活性的变化鲜有报道。

体外消化模型是模拟人类消化时真实的生理条件，是研究摄入物质的变化、相互作用以及营养物质生物可及性的有用工具[11]。本研究选取五种生活中常见的可食用花卉（桂花、万寿菊、栀子花、紫玉兰花、木槿花），对经过体外模拟消化后的可食用花卉样品中多酚、黄酮含量进行测定，并通过三种体外抗氧化方法（ABTS、FRAP、DPPH），对其自由基清除能力进行测定。通过对五种食用花卉的体内外模拟消化前后的活性成分含量及清除自由基能力对比，并结合对可食用花卉体内外模拟消化前后活性成分及抗氧化能力的相关性分析，为可食用花卉综合利用提供进一步的科学论据。

1. 材料与方法

1.1 材料与仪器

万寿菊、栀子花、紫玉兰花　均于同年4月，木槿花和桂花分别于同年7月和10月采于中南林业科技大学校园；福林酚试剂（Folin-Ciocalteau）、没食子酸　上海源叶生物技术有限公司；胆盐（优级纯）、唾液淀粉酶、胃蛋白酶（800~2500 U/mg）、猪胰蛋白酶（1000~2000 U/mg）　美国Sigma 公司；水溶性维生素E（Trolox）　华蓝化学有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）　日本TIC公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid）、ABTS+　合肥博美生物有限公司。

UV1800型紫外可见光光度计　上海精密科学仪器有限公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅　北京中兴伟业仪器有限公司；ZHWY-2102C型恒温培养摇床　上海智城分析仪器有限公司；101-2AB型电热鼓风干燥箱　天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法 1.2.1 食用花卉提取液的制备

将花卉原料在40 ℃下干燥5 h后用粉碎机快速粉碎，然后过40目筛。称取1 g的花粉，置30 mL超纯水内，于38 ℃，500 W功率下超声波提取40 min后，在4000 r/min的条件下离心8 min后，取上清液进行抗氧化活性成分及其活性的测定[12]。

1.2.2 模拟体外胃消化

食用花卉的体外模拟消化参考文献[13]进行，将消化阶段分为三个小组，分别为模拟胃消化组、盐酸对照组和模拟胃消化空白对照组。每组取1 g样品，均置于40 mL生理盐水中，分别加入0.5 mL模拟胃液（将0.2 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L盐酸溶液中）、0.5 mL 0.01 mol/L HCl和0.5 mL去离子水，后均用0.1 mol/L HCl调pH至2.0，其中模拟胃消化组需先调节pH，再加入0.5 mL模拟胃液。将模拟胃消化组、盐酸对照组、模拟胃消化空白对照三组避光，填入氮气，在37 ℃、120 r/min振荡消化2 h，在体外模拟胃消化的0、1、2 h分别吸取10 mL的消化液，于14000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液进行抗氧化活性成分及其清除自由基能力的测定。

1.2.3 模拟体外肠消化

肠消化阶段设定肠消化组和汤消化空白对照组，取1 g样品，加40 mL生理盐水后，用0.1 mol/L HCl调pH至2.0，再加入0.5 mL模拟胃液，避光，填入氮气，在37 ℃、120 r/min振荡消化2 h。向样品中继续加入1 mol/L NaHCO3溶液至pH 7.0，加入1 mL模拟肠液（将4 g胰酶和25 g胆汁盐溶于1 L 0.1 mol/L NaHCO3溶液），避光，填入氮气，在37 ℃、120 r/min振荡2 h。在体外模拟肠消化的0、1、2 h分别吸取10 mL的消化液，于14000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液进行测抗氧化活性成分及其自由基清除力的测定，肠空白对照组中的模拟肠液以等体积的NaHCO3代替[13]。

1.2.4 多酚、黄酮含量的测定 1.2.4.1 多酚的测定

依据福林-酚比色法[14]测定样品多酚含量。取1 mL样品溶液于25 mL比色管，用去离子水定容至23 mL，取0.300 mL现配的10%的碳酸钠溶液、500 μL的福林试剂与上述标样混匀，静止40 min后，在波长760 nm处用紫外分光光度计测定其吸光值。以没食子酸浓度C（X）对吸光值A（Y）作曲线得到标准曲线方程（Y=2.6722X−0.0052, R2=1），根据上述步骤制备并测定样品消化液的吸光度，以每克干样品中多酚含量（mg GAE/g）为单位计算其多酚的含量。

1.2.4.2 黄酮的测定

参考Acácio等[15]采用亚硝酸钠-氯化铝法。取250 μL的样液于试管中，用30%乙醇定容至2970 μL，再分别加入120 μL的0.5 mol/L亚硝酸钠溶液，反应10 min，加入120 μL氯化铝于试管再反应10 min。最后加入800 μL的1 mol/L NaOH溶液，在510 nm波长处用紫外分光光度计测其吸光度，用30%乙醇作空白，以儿茶素浓度C（X）对吸光值A（Y）作曲线得到标准曲线方程（Y=1.3925X+0.0189，R2=0.9995），以每克样品中黄酮含量（mg CE/g）为单位计算其黄酮的含量。

1.2.5 抗氧化活性测定 1.2.5.1 DPPH自由基清除力的测定

参考文献[16]的实验方法，经过适当的修改。吸取300 μL提取液于试管中，将1.9 mL 0.094 mmol/L DPPH溶液分别加入试管中，混合均匀后避光保存40 min，在波长517 nm处用紫外分光光度计测定其吸光度，80 %的甲醇调零机器。以Trolox 浓度C（X）对吸光值A（Y）作曲线得到标准曲线方程（Y=−8.65X+0.571，R2=0.999）。以样品每克的Trolox当量（μmol Trolox/g）为单位计算其抗氧化能力。

1.2.5.2 铁离子还原力的测定

参考文献[17]实验方法测定。用40 mmol/L HCl配制10 mmol/L的TPTZ 2.5 mL，加入25 mL 0.3 mol/L pH3.6的醋酸缓冲液和2.5 mL的20 mmol/L FeCl3，混合均匀后加热至37 ℃，制成了FRAP试剂。吸取900 μL的提取液或者是80%甲醇配制的100 μmol/L Trolox标准液180、360、450、540、630、720、900 μL于试管中，分别加入270 μL的去离子水和2.7 mL的FRAP试剂，混匀后37 ℃水浴40 min，在波长595 nm处用紫外分光光度计测定其吸光度，蒸馏水调零。以Trolox浓度C（X）对吸光值A（Y）作曲线得到标准曲线方程（Y=10.033X+0.1247，R2=0.999）。根据上述步骤测定样品消化液的吸光值，以每克样品中Trolox当量（μmol Trolox/g）为单位计算其抗氧化能力。

1.2.5.3 ABTS+自由基清除力的测定

参考文献[18]方法，经过适当修改。取体积相同的7.4 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合，避光封口保存12~16 h，稀释ABTS无水乙醇溶液直到该溶液在734 nm处的吸光值为0.68~0.72时即得到ABTS试样溶液。将4 mL ABTS试样溶液，与1 mL提取液及无水乙醇配制的0.1 mmol/L Trolox标准液（0.200、0.400、0.500、0.600、0.700、0.800 mL）混合，在734 nm处利用紫外分光光度计进行测定，无水乙醇作为空白。以Trolox浓度C（X）对吸光值A（Y）作曲线得到标准曲线方程（Y=−6.3314X+0.5543，R2=0.9998）。依据上述步骤测定样品消化液的吸光值，以每克样品的Trolox当量（μmol Trolox/g）为单位计算抗氧化能力。

1.3 数据处理

所有数据平行测定三次，结果用均数±标准差表示，数据处理采用SPSS20统计软件，采用Origin8.5软件作图，P<0.05表示有显著性变化。

2. 结果与分析

2.1 未消化时食用花卉多酚、黄酮含量及抗氧化活性 2.1.1 五种可食用花卉未消化时多酚和黄酮含量

未消化前五种可食用花卉其多酚和黄酮含量见表1。不同的可食用花卉样品中的多酚和黄酮含量具有显著性差异（P<0.05）。五种样品的多酚含量在0.717~1.495 mg GAE/g之间、黄酮含量在12.249~74.476 mg CE/g范围内。其中，万寿菊的多酚含量最高，高达1.495 mg GAE/g，其余样品多酚含量由高到低依次为木槿花>紫玉兰花>桂花>栀子花；黄酮含量以桂花最高，含量为74.476 mg CE/g，其余样品黄酮含量由高到低则依次是木槿花>万寿菊>栀子花>紫玉兰花。

表 1 五种可食用花卉的抗氧化成分含量

Table 1. Antioxidnat components content of 5 edible flowers

品种多酚（mg GAE/g）黄酮（mg CE/g）桂花0.898±0.001d74.476±0.436a万寿菊1.495±0.005a21.032±0.057c栀子花0.717±0.002e17.165±0.087d紫玉兰花0.991±0.003c12.249±0.018e木槿花1.017±0.004b23.202±0.061b 2.1.2 五种可食用花卉未消化时抗氧化活性

图1展示了五种食用花卉在未消化时抗氧化活性的对比。不同品种的可食用花卉中的各种抗氧化活性成分具有显著性差异（P<0.05）。五种食用花卉的ABTS+自由基清除力在0.568~3.361 μmol Trolox/g之间，铁离子还原力在56.047~733.792 μmol Trolox/g之间，DPPH自由基清除力在0.580~1.492 μmol Trolox/g之间。其中万寿菊的ABTS+自由基清除力和铁离子还原力均是最高，木槿花的DPPH抗氧化活性最高。综合三种抗氧活性方法可知抗氧化活性最强的为万寿菊，其次是木槿花、紫玉兰花、桂花及栀子花，其中万寿菊和木槿花又具有较高含量的多酚和黄酮，表明相对其它食用花卉可能具有更好的开发利用潜力。

图 1 5种食用花卉抗氧化活性

注：图中同类柱形图的不同字母表示有显著性差异（P<0.05）。

Figure 1. Antioxidant activity of 5 kinds of edible flowers

2.2 体外模拟消化过程中多酚、黄酮含量的变化 2.2.1 体外模拟消化对多酚类含量的影响

图2展示了五种可食用花卉在体外模拟胃肠消化过程中多酚释放量的变化情况。在胃消化阶段0~2 h 内，五种可食用花卉在胃消化过程中多酚释放量的变化较小，胃消化空白对照组与盐酸对照组无明显区别。5种花卉模拟胃消化后的多酚含量，与刚消化时相比，增长了6.2%（桅子）~28.3%（木槿），也明显高于胃空白对照组和未消化组。而经过4 h体外模拟胃肠消化后，5种食用花卉的多酚含量明显增加，相对于模拟消化0 h，显著增加1.28倍（桂花）~4.62倍（万寿菊），总含量也是万寿菊最高，达（8.95±0.03） mg GAE/g，是万寿菊未消化时多酚含量的6.0倍。由此可知，体外模拟肠消化比体外模拟胃消化更加有利于多酚的释放，其原因可能是，包围在多酚外并与多酚结合的蛋白质物质，被在模拟胃消化阶段时的胃蛋白酶水解成小分子多肽，使酚酸从中分离出来，而体外模拟肠消化将多肽进一步水解，或在胰酶和碱性环境下，结合酚被解离成自由酚，使得多酚含量增加[19]。

图 2 五种食用花卉模拟胃、肠消化过程中多酚释放量的变化

注：A：桂花；B：万寿菊；C：栀子花；D：紫玉兰花；E：木槿花；图3~图6同。

Figure 2. Variation of total phenolics contents of 5 edible flowers after simulated gastric and gastrointestinal digestion

2.2.2 体外模拟消化对黄酮含量的影响

图3呈现了五种食用花卉体外模拟胃肠消化过程中黄酮释出情况的变化趋势，可食用花卉在模拟体外消化过程中总黄酮释放量的变化趋势与总多酚相似。在胃消化模拟过程，与多酚释放量相比，食用花卉的黄酮释放量变化趋势相对较大，0~2 h模拟胃消化阶段中，万寿菊黄酮释放量（10.5 mg CE/g）是未消化时（6.5 mg CE/g）的1.62倍，黄酮释放量的增长速率明显高于其他花卉种类；黄酮释放量在肠消化2 h内持续增加，2 h后达到最大释放量（22.147 mg CE/g）是胃消化2 h（10.948 mg CE/g）的2.02倍，万寿菊的黄酮含量以60%的增长位居五样品之首，远高于其他食用花卉的黄酮释放量增长速率。

图 3 五种可食用花卉模拟胃、胃肠消化提取液中黄酮释放量的变化

Figure 3. Variation of total flavonoids of 5 edible flowers after simulated gastric and gastrointestinal digestion

多酚类物质是总黄酮类化合物中的一类主要功能活性物质，在自然界分布非常广泛，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、防治心脑血管疾病等多种药理功能[20]。在体外模拟消化阶段，五种可食用花卉的多酚释放量与黄酮释放量在肠消化阶段的释放量均要高于胃消化阶段，由此可推断，胆汁及胰酶可进一步增加了食用花卉中多酚物质和黄酮物质的释出[21]。

2.3 体外模拟消化过程中食用花卉抗氧化活性的变化 2.3.1 DPPH自由基清除能力

图4呈现了五种可食用花卉DPPH自由基清除能力在体外模拟胃消化条件下的变化趋势。五种食用花卉DPPH自由基清除率的上升范围为3%（木槿）~18.6%（玉兰），其中桂花的DPPH自由基清除能力最强，达到6.413 μmol Trolox/g。胃空白对照组的DPPH自由基清除率在模拟胃消化前后均无显著差异（P>0.05）。在肠消化阶段，五种花卉的DPPH自由基清除率也呈快速上升趋势，以栀子花的DPPH自由基清除能力上升最大。体外模拟胃肠消化4 h后，DPPH自由基能力上升了77.0%（木槿）~158.05%（栀子花），同时桅子花的DPPH自由基清除力又是五种花卉中最高的，达到了（14.856±0.04） μmol Trolox/g，是DPPH自由基清除率最低的木槿花的1.5倍。

图 4 五种可食用花卉模拟胃、胃肠消化过程DPPH自由基清除能力的变化

Figure 4. Variation of DPPH radical scanvening ability of 5 edible flowers after simulated gastric and gastrointestinal digestion

2.3.2 铁离子还原力

从图5可以看出，不同种可食用花卉之间的抗氧化能力存在一定差异。在胃消化阶段，两对照组变化不明显，经过2 h体外模拟胃消化后，铁离子还原力的上升范围为3.07%（桂花）~38.33%（栀子花）。但以万寿菊的铁离子还原力最高，达（301.68±0.04） μmol Trolox/g。进一步经2 h的模拟肠消化，五种食用花卉的铁离子还原力进一步上升。在整个4 h的胃肠消化阶段，铁离子还原能力上升15.30%（桂花）~163.92%（桅子花），而模拟胃肠消化完后铁离子还原力最大的是万寿菊，达（399.48±0.04） μmol Trolox/g，这可能是由于其消化前本身就有很高的铁离子还原能力（273.35±0.04） μmol Trolox/g。

图 5 五种可食用花卉模拟胃、胃肠消化过程铁离子还原能力的变化

Figure 5. Variation of FRAP of 5 edible flowers after simulated gastric and gastrointestinal digestion

2.3.3 ABTS+自由基清除能力

图6呈现了五种可食用花卉ABTS+自由基清除率在体外模拟胃肠消化过程中的变化情况。胃空白对照组ABTS+自由基的清除作用在消化前后几乎没有改变（P>0.05）；而模拟胃消化后仅可有效提高桂花ABTS+自由基的清除效率（P<0.05），在0~2 h，五种食用花卉的ABTS+自由基清除能力中增长了4.06%（紫玉兰花）~36.05%（桂花），而最大ABTS+自由基清除能力（3.62±0.05） μmol Trolox/g。进一步肠消化则促进了ABTS+自由基清除能力的增长。整个胃肠消化中，ABTS+自由基清除能力增长了142.35%（紫玉兰花）~274.18%（桅子花）。而经过4 h的胃肠模拟消化后，桅子花的ABTS+自由基清除能力也最大，达（8.66±0.03） μmol Trolox/g。

图 6 五种可食用花卉模拟胃、胃肠消化过程ABTS+自由基清除能力的变化

Figure 6. Variation of ABTS+ radical scanvening ability of 5 edible flowers after simulated gastric and gastrointestinal digestion

在体外模拟消化研究中，五种可食用花卉在经过体外模拟胃肠消化后清除自由基能力明显增强，其自由基清除能力均大于未消化的样品提取液，此变化离不开多酚、黄酮等物质的增加。从彦丽等[22]通过对梨的相关研究表明体外模拟消化后，3种梨的抗氧化值增加了2.15～3.42倍；肠消化阶段抗氧化值增加了1.12～1.34倍。周笑犁等[19]研究发现，蓝莓皮经过体外模拟胃消化、体外模拟胃肠消化后，其自由基清除能力增强136.7%。这与本文的实验结果相一致。表明这些可食用的花果类经过体外模拟胃肠消化后，其抗氧化活性成分和自由基清除能力能得到一定的提高。

2.4 体外模拟消化条件下多酚、黄酮与抗氧化活性的相关性分析

多酚类化合物和黄酮类化合物是植物中天然存在的次生代谢物，能够通过多种途径清除多种体内外存在的自由基，从而发挥良好的抗氧化能力，这些因素最终都会对提取物的抗氧化活性产生较大的影响[23]。表2和表3展示了体外模拟胃肠消化条件下,五种花卉多酚、黄酮含量与3种抗氧化评价指标之间的相关系数。在体外模拟胃肠消化阶段，多酚、黄酮含量和自由基清除能力间均存在强的正相关（R2=0.735～0.999，P<0.05）。其中在体外模拟胃消化阶段，万寿菊的相关性最高（R2=0.881～0.999，P<0.05）；在体外模拟肠消化阶段，栀子花的相关性最高（R2=0.834～0.996，P<0.05）。这进一步证明了体外模拟胃肠消化有助于万寿菊、栀子花等可食用花卉多酚和黄酮类化合物的增长以及自由基清除能力的提升，良好的多酚、黄酮释放能力是提高其生物可及性的基础，较好的多酚、黄酮释放能力和抗氧化活性也表明其有较好的开发为食用花卉功能食品的潜力。

表 2 不同可食用花卉在模拟胃消化过程中的多酚、黄酮含量与抗氧化活性之间的相关系数

Table 2. Correlation coefficients between antioxidant activity and phenolics (TPC,TFC) in different edible flowers during simulated gastric digestion

相关项目桂花万寿菊栀子花紫玉兰花木槿花P-1P-2P-3P-1P-2P-3P-1P-2P-3P-1P-2P-3P-1P-2P-3 多酚DPPH0.9810.8640.930 0.9390.9990.982 0.9990.8800.735 0.9760.9920.949 0.8860.9190.875FRAP0.9730.9070.9550.9080.9970.9370.9950.8980.8590.9920.9900.9720.8710.8750.991ABTS0.9510.8850.9210.9970.9990.9800.9990.8720.8330.9910.9190.9930.9140.8290.973黄酮DPPH0.9220.9190.9270.9950.9890.9990.9940.9730.8500.9290.9880.7210.9740.9190.875FRAP0.9080.9520.9530.9830.9640.8810.9710.9690.9000.9610.9910.7740.9660.8750.991ABTS0.8710.9350.9180.9860.9860.9440.9940.9810.8670.9580.9920.8390.9870.8290.973 注：P-1、P-2、P-3代表盐酸对照组、胃消化组、胃空白对照组。

表 3 不同可食用花卉在模拟肠消化过程中的多酚、黄酮含量与抗氧化活性之间的相关系数

Table 3. Correlation coefficients between antioxidant activity and phenolics (TPC,TFC) in different edible flowers during simulated intestinal digestion

相关项目桂花万寿菊栀子花紫玉兰花木槿花C-1C-2C-1C-2C-1C-2C-1C-2C-1C-2 多酚DPPH0.7850.885 0.870.73 0.9540.8341 0.9850.909 0.9220.963FRAP0.9250.930.8730.840.9630.960.8910.7970.9430.922ABTS0.8180.870.8640.8120.9890.970.9060.8570.9440.989黄酮DPPH0.9110.9490.9860.9870.9530.9570.9710.9950.9220.94FRAP0.9940.9940.9750.9780.9960.9450.9880.9870.9490.969ABTS0.9030.9370.9850.9930.9550.9670.9990.9980.9450.967 注：C-1、C-2代表肠空白对照组、肠消化组。

3. 结论

本研究通过体外模拟消化的方法，探讨五种可食用花卉在胃肠消化过程中多酚含量、总黄酮含量的变化规律，以DPPH、FRAP和ABTS+自由基清除能力为指标考察其抗氧化活性的变化情况。结果表明体外模拟消化过程中五种可食用花卉的多酚、黄酮释放量以及抗氧化能力均有一定程度的提升，但五种可食用花卉在模拟胃阶段的黄酮和多酚的释放量远小于模拟肠阶段的释放量，其自由基清除能力通过模拟肠消化后能大幅提升。五种食用花卉中，以万寿菊的多酚和黄酮释放量最高，三种抗氧化活性增长比例最大的桅子花，结果表明，万寿菊和桅子花具好相对较高的生物活性价值。本文未能对其生物可及性和利用率进行研究，后续可进一步通过细胞模型或动物模型考察其主要活性物质的吸收和利用情况，运用液质联用技术研究单体多酚类化合物的具体变化。本研究为这些食用花卉的深加工利用提供了较好的科研理论依据，有望作为天然抗氧化功能食品的原料来源。