芍药TDC基因及其植物表达载体和应用的制作方法

• 花匠小妙招
• 2024-11-30 21:12

本发明属于园艺栽培领域，具体涉及一种芍药tdc基因序列及其植物表达载体和应用。

背景技术：

褪黑素是一种重要的吲哚胺化合物，广泛存在于几乎所有的生物体中。在动物中，褪黑素在调节昼夜节律，提高免疫力，抗衰老和抗癌等方面具有重要的功能。自1995年在植物中第一次检测到，褪黑激素已在许多植物物种中被发现，现在被认为是一种重要的能促进健康的天然物质，因为它在延缓衰老和抗氧化活性方面具有重要作用。此外，褪黑素在植物发育中起着关键作用，包括种子发芽、根系生长、开花、叶片衰老，以及植物抗逆性，例如提高耐热性和耐干旱性、耐盐性，减轻重金属的损害，保护植物免受紫外线辐射，改善它们抵御病原体感染的防御等。

目前在植物中褪黑素的合成路径已经研究的相当透彻，第一步反应色氨酸脱羧酶(tdc)催化色氨酸生成色胺，然后经过色胺5-羟化酶(t5h)催化生成5-羟色胺，又经5-羟色胺-n-乙酰转移酶(aanat)生成n-乙酰-5-羟色胺，最后n-乙酰-5-羟色胺经羟基吲哚氧甲基转移酶(hiomt)催化合成褪黑素。在这些酶中，tdc酶被认为是褪黑素合成过程中的第一个限速酶，它与褪黑素的合成密切相关，研究表明，过表达tdc基因可以提高5-羟色胺的含量，从而提高褪黑素的产量[5]。然而，这些研究在药用植物和食品植物中得到了广泛的应用，而在观赏植物体内，关于tdc对褪黑素生物合成以及对植物抗逆性提高方面的意义仍然有待确定，并且少有文献报道使用转基因的方法来验证tdc基因的功能，同时转基因植物的其他性能也尚未得到系统的研究。

芍药为芍药科芍药属多年生宿根草本花卉，是我国的传统名花，被誉为“花中宰相”，距今已有4000多年的栽培历史。因其花大色浓，花型丰富，品种繁多，观赏价值极高，备受喜爱，被广泛应用于城市绿化、庭院、专类园等露地栽培中进行观赏。在我们前期试验中，我们在芍药花、叶、根中检测出了褪黑素，但对芍药中褪黑素的生物合成规律及其潜在的分子机制知之甚少，tdc基因的功能也有待研究。

在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将芍药tdc基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有强抗逆性的新种质，对于优良植物新品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提高植物的抗逆性，提供一个新的芍药‘紫凤羽’抗逆基因pltdc及其植物表达载体和应用。

本发明采用的技术方案是：

芍药‘紫凤羽’抗逆基因pltdc，该基因的序列为seqidno.1。

芍药‘紫凤羽’抗逆基因pltdc的植物表达载体，由本发明所述的芍药‘紫凤羽’抗逆基因pltdc与中间植物表达载体pcambia1301构成。

芍药‘紫凤羽’抗逆基因pltdc植物表达载体，其构建方法如下：

(1)芍药‘紫凤羽’抗逆pltdc的克隆：以芍药‘紫凤羽’盛开期花瓣为材料，提取总rna，反转录为cdna，设计3′扩增引物3′raceouterpcr引物：5′-gtagcaaacgattatggag-3′(seqidno.2)和3′raceinnerpcr引物：5′-gttacttggattgctgttg-3′(seqidno.3)以及5′扩增引物5′-gtttccgtgtcacccaactcagagca-3′(seqidno.4)，进行pcr扩增。将获得的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并回收，产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体(北京全式金生物技术有限公司)，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆进行序列测定；

(2)植物表达载体pcambia1301-pltdc的构建：根据已经获得的tdc基因cdna全长序列的基础之上，以芍药‘紫凤羽’cdna为模板设计引物，进行pcr扩增，在pltdc基因cdna序列的上游和下游分别引入bamhi和kpni酶切位点，上游引物pltdc-mf：5′-cgcggatccatgggtagtcttgaac-3′(seqidno.5)，下游引物pltdc-mr：5′-gggtaccctaacaccccttgagtat-3′(seqidno.6)；pcr产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，bamhi和kpni双酶切的pltdc片段与bamhi和kpni双酶切的pcambia1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切，电泳检测并测序验证，植物表达载体pcambia1301-pltdc构建成功。

本发明还公开了所述芍药基因pltdc在提高植物的抗逆性、创制抗逆新种质中的应用。

所构建的芍药基因pltdc的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高植物褪黑素含量，从而提高植物抗性，创制抗逆新种质。方法如下：农杆菌菌株eha105感受态制备及冻融法转化；烟草叶片浸染及生根筛选；转基因植株检测及鉴定。

本发明的有益效果体现在：

1、本发明提供的芍药‘紫凤羽’pltdc是一个新的抗逆基因，该基因可提高植物的褪黑素积累水平，从而提高植物抗逆性。

2、本发明构建的芍药‘紫凤羽’pltdc基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高植物的褪黑素积累、创制抗逆性强的新种质。

附图说明

图1琼脂糖凝胶电泳检测，图中：m1：dl2000；m2：dl15000；1：pltdc基因的dna序列扩增产物；2,3：pltdc基因的cdna序列扩增产物；4,5：pcambia1301-pltdc质粒双酶切产物。

图2植物表达载体pcambia1301图谱。

图3转基因植株的鉴定，图中：a：野生型和转基因植株烟草表型；b：pcr鉴定；c：褪黑素含量积累水平；d：tdc相对表达量。wt:野生型植株；line1，line2，line3：转基因植株。

图4干旱胁迫后烟草植株的表型及相关指标测定。图中：a：干旱胁迫后烟草植株的表型；b：dab染色法观测h2o2积累水平；c：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平；d：相对电导率；含水量；psii原初光能转化效率；e：相关基因表达水平。wt:野生型植株；line1，line2：转基因植株。

图5高温胁迫后烟草植株的表型及相关指标测定。图中：a：干旱胁迫后烟草植株的表型；b：dab染色法观测h2o2积累水平；c：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平；d：相对电导率；含水量；psii原初光能转化效率；e：相关基因表达水平。wt:野生型植株；line1，line2：转基因植株。

图6盐胁迫后烟草叶片的表型及相关指标测定。图中：a：不同盐浓度处理的烟草叶片表型；b：dab染色法观测h2o2积累水平；c：荧光探针法观测超氧阴离子积累水平。

具体实施方式

实施例1.pltdc的cdna序列克隆

选用芍药‘紫凤羽’成熟期花瓣作为材料，参照minibestplantrnaextractionkit试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，取1μg总rna反转录成cdna。反转录体系：totalrna1.0μl，3′raceadaptor(5μm)1.0μl，5×m-mlvbuffer1.0μl，dntpmixture(10mmeach)2μl，rnaseinhibitor(40u/μl)，reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-)(200u/μl)0.25μl，rnasefreeddh2o4.5μl。反转录程序：42℃反应60min，70℃延伸15min。

以提取的叶片cdna为模板，设计3′raceouter引物和3′raceinner引物进行pcr反应：3′raceouterpcr引物：5′-gtagcaaacgattatggag-3′(seqidno.2)，50μl反应体系：1×cdnadilutionbufferⅱ8μl，genespecificouterprimer(10μm)2.0μl，3′raceouter引物2.0μl(10μm)，10×lapcrbufferⅱ(mg2+plus)5.0μl，takaralataq(5u/μl)0.5μl，cdna模板2.0μl,，ddh2o30.5μl。反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，反应20个循环，72℃延伸10min。3′raceinnerpcr引物：5′-gttacttggattgctgttg-3′(seqidno.3)，50μl反应体系：outerpcr产物1.0μl，dntpmixture(2.5mmeach)8μl，10×lapcrbufferⅱ(mg2+plus)5.0μl，genespecificinnerprimer(10μm)2.0μl，3′raceinner引物2.0μl，takaralataq(5u/μl)0.5μl，ddh2o31.5μl。反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min。将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并分离回收。

之后进行5′racepcr反应，反转录ⅰ体系：rna1.0μl，5′-cdsprimera1.0μl，sterileh2o9.0μl，反应条件：72℃反应3min，42℃反应2min。反转录ⅱ体系：上述反应液11μl，5×first-strandbuffer4.0μl，dtt(100mm)0.5μl，dntpmix(20mm)1.0μl，smarterⅱaoligonucleotide1.0μl，rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl，smartscribereversetranscriptase2.0μl。反应程序：42℃反应90min，70℃反应10min。然后用50～70μltricine-edtabuffer常温稀释cdna15min，反应液立即进行下一步实验。以cdna为模板，设计5′race引物：5′-gtttccgtgtcacccaactcagagca-3′(seqidno.4)，clontechpcr反应体系：pcr-gradewater15.5μl，2×seqampbuffer25.0μl，seqampdnapolymerase1.0μl，5'-race-readycdna2.5μl，10×upm5.0μl，5′-racetfr引物(10μm)1.0μl。反应程序：94℃变性30sec，72℃延伸3min，反应5个循环，94℃变性30sec，70℃反应30sec，72℃延伸3min，反应5个循环，94℃变性30sec，68℃反应30sec，72℃延伸3min，反应25个循环。pcr结束后使用1％的琼脂糖电泳检测，产物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化，产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体(trans)，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆进行测序，序列测定为seqidno.1。

实施例2.植物表达载体pcambia1301-pltdc的构建

设计引物pltdc-mf、pltdc-mr进行pcr反应，在pltdccdna序列的上游和下游分别引入酶切位点bamhi和kpni，pcr产物连接到peasytm-t5zerocloningvector载体，转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的lb平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，bamhi和kpni双酶切的pltdc片段与bamhi和kpni双酶切的pcambia1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切，电泳检测并测序验证，具体步骤如下：上游引物pltdc-mf：5′-cgcggatccatgggtagtcttgaac-3′(seqidno.5)，下游引物pltdc-mr：5′-gggtaccctaacaccccttgagtat-3′(seqidno.6)。(1)根据已经获得的tdc基因cdna全长序列的基础之上，以芍药‘紫凤羽’叶片cdna作为模板，设计引物pltdc-cf：5′-gttgggtgacacggaaac-3′(seqidno.7)和pltdc-cr：5′-gaccgcaaatctcagcat-3′(seqidno.8)进行pcr反应，25μl反应体系：10×lapcrbufferⅱ(mg2+plus)2.5μl，pltdc-cf、pltdc-cr引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，takaralataq(5u/μl)0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性5sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，反应35个循环，72℃延伸10min；pcr产物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化。

(2)取表达载体pcambia1301质粒和含酶切位点的pltdc胶回收产物分别用bamhi和kpni双酶切，20μl双酶切反应体系：0.5×kbuffer2.0μl，质粒pcambia1301或pltdc胶回收产物10μl，bamhi1.0μl，kpni1.0μl，ddh2o6.0μl；37℃反应1.5h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝胶回收试剂盒(takara)回收纯化质粒pcambia1301大片段和pltdc大片段。用t4dna连接酶(takara)连接两个回收的产物，20μl连接反应体系：10×t4ligasebuffer1.0μl，t4dnaligase1.0μl，pcambia1301大片段1.0μl，pltdc大片段10μl，ddh2o7μl；22℃室温连接15min后65℃水浴10min，取5μl连接产物转化trans-t1感受态细胞，而后在附加0.05％卡那霉素的lb平板上37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pcambia1301-pltdc，对质粒进行双酶切(图2)，并测序验证。植物表达载体pcambia1301-pltdc构建成功。

实施例3.植物表达载体pcambia1301-pltdc遗传转化烟草及其抗逆能力鉴定

(一)农杆菌菌株eha105感受态制备及冻融法转化

从yeb(50μg/ml利福平)平板上挑取eha105单菌落，接种于5ml含有50mg/l利福平的yeb液体培养基中，28℃、200rpm培养至od600值0.5，而后冰浴菌液30min，转至预冷的50ml离心管中，4℃、5000rpm、离心10min收集菌体，悬浮于10ml预冷的50mmcacl2(不含甘油)溶液中，4℃、5000rpm、离心10min，弃上清。悬浮于2.0ml预冷50mmcacl2(15％甘油)溶液中菌体即为感受态细胞，混匀后以100μl/管分装在1.5ml灭菌离心管中，液氮冷冻后-80℃保存待用。

取5μl表达载体质粒，加入100μleha105感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃热击5min，加入800μl无抗生素yeb液体培养基，28℃、200rpm预培养5h，菌液涂板于yeb(50μg/ml利福平+50μg/ml卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆pcr检测，选取阳性克隆摇菌，用于烟草叶片转化。

(二)烟草叶片遗传转化与筛选

挑取农杆菌eha105单菌落于yeb液体培养基中(rif50mg/l，kan50mg/l)，28℃，200rpm培养过夜。取所摇菌液2ml加入50ml含有相同抗生素的液体yeb中，在相同条件下培养至od600＝0.3-0.4。将摇好的菌倒入50ml离心管中，室温5000rpm，10min，弃上清备用。先在灭菌后的小三角瓶中加入400μlas(乙酰丁香酮20mg/ml)，向离心管中加入5mlms(ms液体基本培养基，不调ph，不加琼脂、蔗糖)将溶解菌体，用枪打匀，倒入加有400μlas的小三角瓶中，然后加ms至50ml。向另一个灭菌小三角瓶中加入50mlms(ms液体基本培养基，不调ph，不加琼脂、蔗糖)备用。取烟草的无菌苗叶片，切成小块(约1cm×1cm)，放入50ml加有ms小三角瓶中，共切100-150片叶片放入瓶中，将叶片倒入覆有纱布的烧杯，取经过滤后的叶片加入50mlms+as的小三瓶中，侵染8min，侵染时不断轻轻摇动；侵染完成后，滤去菌液，取出叶片，用无菌滤纸吸干叶片表面多余的菌液，接种于共培养培养基[ms+6-ba(6-苄基腺嘌呤)(3.0mg/l)+naa(α-萘乙酸)(0.1mg/l)+蔗糖(30g/l)+6.66％琼脂]中，暗培养3d；共培养结束后，转入抗性芽筛选分化培养基[ms+6-ba(3.0mg/l)+naa(0.1mg/l)+蔗糖(30g/l)+6.66％琼脂+cb(羧苄青霉素)(100mg/l)+hyg(潮霉素b)(25mg/l)]中进行选择培养，两周继代一次，直到分化出芽；当分生不定芽达2cm以上时，切下不定芽，转入生根筛选培养基[1/2ms+iba(吲哚-3-丁酸)(0.3mg/l)+蔗糖(30g/l)+6.66％琼脂+cb(50mg/l)+hyg(8mg/l)]进行生根筛选。

(三)转基因植株鉴定及抗逆性能力评价

(1)转基因植株鉴定：

①pcr鉴定：采集烟草叶片为材料，参照rnaisoplus(totalrna提取)试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara)取1.0μg总rna反转录成cdna。将反转录所得的cdna进行pcr扩增、电泳检测，以烟草actin为内参基因，设计引物为：上游引物atactin-f：5′-actgctgaacgggaaatt-3′(seqidno.9)，下游引物atactin-r：5′-atggctggaacaggactt-3′(seqidno.10)；pltdc扩增的上游引物pltdc-cf：5′-gttgggtgacacggaaac-3′(seqidno.11)，下游引物pltdc-cr：5′-gaccgcaaatctcagcat-3′(seqidno.12)；25μl反应体系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，上游引物、下游引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，la高保真酶0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反应程序：94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应35个循环，72℃延伸10min；使用1％琼脂糖凝胶电泳检测。从图4b中可以看出，野生型烟草植株中未扩增出pltdc片段，而转pltdc植株中能扩增出1条清晰明亮的条带，再次表明表达载体pcambia1301-pltdc已成功导入烟草。

(2)植株抗逆性能力评价：

①植株表型：

干旱胁迫：将经pcr鉴定成功的转基因苗置于22℃，10h光照/14h黑暗条件下干旱胁迫18d，而后观察植株的生长情况。图4为植株在干旱胁迫后的生长情况，野生型烟草植株的叶片出现了失水、萎蔫的干旱伤害症状，而转pltdc植株的叶片表现良好，并未出现上述的干旱伤害症状。

高温胁迫：将经pcr鉴定成功的转基因苗置于42℃高温条件下胁迫处理72h，而后观察植株的生长情况。图5为植株在高温胁迫后的生长情况，野生型烟草植株的叶片出现了黄化、卷缩的高温伤害症状，而转pltdc植株的叶片表现良好，并未出现上述的高温伤害症状。盐胁迫：用打孔器从健康的野生型和转基因烟草植株中提取叶片，并放入0mm、200mm、400mm、600mm和800mm的nacl溶液中36h，而后观察叶片形态。图6为叶片在盐胁迫后的情况，野生型烟草叶片颜色变深，800mmnacl溶液中叶片完全变成深褐色，而转pltdc叶片褐色面积较少，表现出更强的耐盐能力。

②pltdc基因表达水平

以烟草的叶片为材料，参照rnaisoplus(totalrna提取)试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara)取1.0μg总rna反转录成cdna。将反转录所得的cdna按照tipgreenqpcrsupermix试剂盒(trans)进行qrt-pcr检测，以烟草actin为内参基因，设计引物为：上游引物atactin-f：5′-actgctgaacgggaaatt-3′(seqidno.9)；下游引物atactin-r：5′-atggctggaacaggactt-3′(seqidno.10)；设计pltdc基因引物为：上游引物pltdc-qf：5′-gttgggtgacacggaaac-3′(seqidno.11)；下游引物pltdc-qr：5′-gaccgcaaatctcagcat-3′(seqidno.12)；25μl反应体系：tipgreenqpcr12.5μl，cdna模板2.0μl，上游引物、下游引物各1.0μl(10mm)，ddh2o8.5μl；反应程序：94℃预变性30sec，然后94℃变性5sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应45个循环，溶解曲线65℃-95℃，每5sec升温0.5℃；采用公式2-△△ct法计算基因的相对表达量。从图3d中可以看出，pltdc在野生型烟草植株中的表达水平与转pltdc植株相差较大，转pltdc植株的表达水平显著高于野生型。

③相关基因的表达水平

以烟草的叶片为材料，参照rnaisoplus(totalrna提取)试剂盒(takara)说明书方法提取总rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒(takara)取1.0μg总rna反转录成cdna。将反转录所得的cdna按照tipgreenqpcrsupermix试剂盒(trans)进行qrt-pcr检测，以烟草actin为内参基因，检测保护酶相关基因cu/znsod，pod，cat，apx和衰老相关基因sag，hin1，cp1，cp2相对表达量。使用primer5.0设计基因的特异型引物，分别是cu/znsod-f：5′-cacttcactcttctttccacg-3′(seqidno.13)，cu/znsod-r：5′-tgacaacgccctcaacat-3′(seqidno.14)；pod-f：5′-tcgtatttctccaacctca-3′(seqidno.15)，pod-r：5′-ccgaatgtcaatccaagt-3′(seqidno.16)；cat-f：5′-cctcgtggttttgctgtc-3′(seqidno.17)，cat-r：5′-ggatttaggatttggcttca-3′(seqidno.18)；apx-f:5′-gatgttccctttcaccct-3′(seqidno.19)，apx-r：5′-tcagatagacccatttgctt-3′(seqidno.20)；sag-f：5′-tctgctttcgtcgttgat-3′(seqidno.21)，sag-r：5′-gattcttccccacctttc-3′(seqidno.22)；hin1-f：5′-tagaaaccccaacaaacg-3′(seqidno.23)，hin1-r：5′-ctcccaataaaaccaagc-3′(seqidno.24)；cp1-f：5′-gcctcacaacagaagtaa-3′(seqidno.25)，cp1-r：5′-aatagagccttctcactg-3′(seqidno.26)；cp2-f：5′-catacatggctgaaggtg-3′(seqidno.27)，cp2-r：5′-acaggctggttggctact-3′(seqidno.28)。25μl反应体系：tipgreenqpcr12.5μl，cdna模板2.0μl，上游引物、下游引物各1.0μl(10mm)，ddh2o8.5μl；反应程序：94℃预变性30sec，然后94℃变性5sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，反应45个循环，溶解曲线65℃-95℃，每5sec升温0.5℃；采用公式2-△△ct法计算基因的相对表达量。从图4e和5e中可以看出，在高温和干旱胁迫下，保护酶相关基因在转pltdc植株中的表达水平显著高于野生型烟草植株，而衰老相关基因在转pltdc植株的表达水平显著低于野生型。

④其他生理指标

褪黑素的测定参照elisa植物褪黑素试剂盒(pt10982)说明书进行。将烟草样品加液氮用研钵研磨均匀，称取0.1g样品冻干粉，置于1.5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲溶液(含5％甲醇，ph＝7.2)，摇晃均匀。将样品置于冰上，使用超声波细胞破碎仪100w(vcx-130,sonics,美国)，超声30s，随后样品匀浆在4℃下10000g离心10min，取上清备用。随后，根据elisa试剂盒(上海桥杜生物技术有限公司)测定褪黑素含量，使用spectramaxm5读卡器(moleculardevicescorporation,美国)读取od值。

测定相对电导率时，称取1g叶片用含有适量蒸馏水的注射器抽真空至叶片沉底后加入试管中，试管中蒸馏水总体积20ml，常温下放置3h后采用电导率仪(雷磁dds-307a，中国)测定电导率e1，同时测定蒸馏水(空白)的电导率e0；然后将试管封口后于沸水浴中煮沸30min，冷却后再测量电导率e2，按下列公式计算叶片相对电导率：相对电导率(％)＝(e1-e0)/(e2-e0)×100％。从图4d、图5d中可以看出，高温胁迫和干旱胁迫下的野生型烟草植株的相对电导率显著高于转pltdc植株。

测定含水量时，取烟草叶片迅速称量鲜重wf，将材料放入一信封内放入烘箱中，在105℃下杀青30min，然后将温度调到80℃烘至恒重，称取其干重wd。自然含水量wc＝wf-wd/wf×100％。

利用叶绿素荧光光谱仪测定叶绿素荧光参数(heinzwalzgmbh91090effeltrich，德国)。

采用dab染色法观测高温、干旱、盐胁迫下h2o2的积累水平，将叶片浸没在使用50mmtris-醋酸盐缓冲液(ph5.0)配成的0.1mg/ml的dab染色液中，在黑暗条件下25℃放置24h，而后在95％的酒精中煮15min再进行拍照；另一方面，参照活体细胞氧化应激活性氧(ros)原位染色试剂盒(超氧阴离子)(上海哈灵)说明书方法观测超氧阴离子的积累水平。从图4、图5、图6中可以看出，野生型烟草植株的dab染色程度和ros的荧光信号均较强，h2o2和超氧阴离子积累水平均显著高于转pltdc植株。

综上所述，本发明构建了含有芍药抗逆基因pltdc的植物表达载体pcambia1301-pltdc，其中pltdc基因的dna序列为首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高烟草植株褪黑素的积累，从而提高在高温、干旱、盐胁迫下的生长势。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>芍药tdc基因及其植物表达载体和应用

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>芍药

<400>1

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gtcttgaacatcccaactccgctcccgcagatcctccttcctctgttccagaattcaacc120

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网址: 芍药TDC基因及其植物表达载体和应用的制作方法 https://m.huajiangbk.com/newsview789039.html