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根癌农杆菌介导的地被菊花的转基因方法

花匠小妙招
2024-12-03 20:00

专利名称：根癌农杆菌介导的地被菊花的转基因方法
技术领域：
本发明属基因工程领域，具体涉及一种根癌农杆菌介导的花色改变外源基因转化地被菊花的方法。
背景技术：
花卉业是一项新兴的产业，花卉已成为人类生活的一类重要商品。目前，国际市场花卉业发展十分迅猛，据资料报道，全世界花卉年贸易总额高达200多亿美元(庄西卿，2004)。在我国农业生产结构调整中，花卉业作为市场潜力巨大的一项新兴产业和新的经济增长点，正在兴起并迅速发展。
菊花(Dendranthema×grandflora Tzvel.)是世界四大切花之一，占全世界花卉产值和花卉销售量的23％(陈俊愉，2003)，在我国的花卉生产中菊花也占有很大的比重。菊花用途广泛，可作为切花花卉(切花菊)，盆栽花卉(盆菊)，茶(饮)用花卉(茶用菊)，还有独特的地被花卉(地被菊)。
在菊属系统学及菊花起源的研究取得丰硕成果的前提下(戴思兰等，2002)，中国工程院院士陈俊愉教授以远缘杂交及品种间杂交为主，充分发挥“野化育种”的威力，进行实生苗选种、芽变选种、辐射育种为辅的地被菊花(Ground-cover Chrysanthemum Group)育种的有效途径，成功地获得了岩菊新品种和第一、第二、第三批地被菊花新品种(Chen等，1995)，并进行了快速、稳定的繁殖和引种推广(高亦珂等，2001；蒋细旺等，2003)。同时地被菊花在抗性育种方面也有显著成效，如抗寒、抗旱、抗病虫害、抗污染、抗盐碱、耐半荫、耐粗放管理能力等(陈俊愉等，1997)。
花色是生产中花卉品质的重要指标。花色色素起主要作用(Stevenson T W，1990；赵云鹏等，2003)。花色色素主要包括三大类群第一类是类黄酮类色素，包括花青苷、黄酮、黄酮醇、苯基苯乙烯酮，都溶于水，该类色素产生从浅黄到蓝紫的全部颜色范围；第二类是胡萝卜素类色类；第三类是与生物碱有关的其它水溶性色素。另外花色还受其他因素的影响，包括色素细胞的pH值、金属离子、辅助色素及花瓣表皮形态等均影响花色(Yabuya等，1993；郑志亮，1996；Tanaka etal.，1998)。植物花色形成涉及到多种基因的协同作用。
其中花色素在植物中主要以花色苷(配糖体)存在。花色苷是类黄酮生化合成的产物。花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，控制花从红色至紫色、蓝色的一系列变化，其含量的增高或降低均可能改变花的颜色。
查尔酮合酶(CHS)是花色苷合成的第一个关键酶，为类黄酮提供了基本的碳骨架，该酶及其衍生物的种类与表达量决定了花色的变化。CHS基因是植物界特有的基因，研究表明该基因在进化中比较保守，其表达受环境和发育的调控。在许多种植物中，CHS基因以多基因家族形式存在，在矮牵牛中由8～10个成员组成(Koeset等，1989)。家族中各成员的基因编码有很高的保守性，在DNA水平上的同源性到达60％以上，在氨基酸水平上的同源性达到80％以上(URSULA等，1987；王金玲等，2000)。不同成员往往受不同的发育调控和组织特异性调控，对不同的外界刺激的敏感程度也不同(MeerM等，1993；YANG等，2004)，这个特点是与黄酮、异黄酮类物质的功能多样性相适应的。在植物正常发育过程中只有CHSA和CHSJ表达，并且这种表达特异地在花发育时期，在花组织中(花冠和花药)大量表达(Drews等，1992；Martin等，1993)，其中研究最多是CHSA基因。CHSA转录的mRNA占总CHS基因家族mRNA的90％，由于CHSA基因的花发育期特异表达，该基因已在多种花卉植物中得到应用。
在菊花的育种中，除传统育种外，诱变育种也是菊花产生新品种的一个主要方法，大规模的商业诱变育种已获得了几百个有价值的商业品种。
1989年Lemieux首先报道了转基因菊花的获得。到目前为止已经从叶片(Ledger等，1991；Urban等，1994)、叶柄(de Jong等，1994)、茎(Renou等，1993；Fukai等，1995)为外植体取得了转基因植株。蒋细旺等(2005)利用根矮农杆菌介导法将Bt的CrylAc基因导入菊花品种‘日本黄’中，获得了对棉铃虫有抗性的转基因植株。
目前利用基因工程手段改造花色的方法有(1)反义抑制法。反义抑制法是抑制类黄酮或类胡萝卜素生物合成基因的活性，从而导致中间产物的积累和花色改变。反义抑制法(或称反义RNA法，Antisense Suppression)，即关键酶基因的反义链连接在一个启动子后转化植物，这种反向DNA转录成的mRNA与内源的互补mRNA结合，抑制靶基因的活性和相应酶的合成，改变花色。该技术可专一性地调节某一基因的活动而不改变该基因的结构(赵昶灵，2003)。即利用反义基因转录产生的反义RNA来抑制目的性状基因的表达，进而修饰目标性状的方法。利用该技术已在矮牵牛(Van等，1988)、菊花(Gutterson等，1994)、康乃馨(Tanaka等，1998)等几种观赏植物中进行了成功的花色修饰。
(2)共抑制法。共抑制法(cosuppression)，即当导入的基因与植物内源基因相同或同源性很高时，外源转化基因和与它同源的内源基因均不会得到表达，相反，却抵制了外源以及内源基因的转录。这种由于外源基因的转入而导致内源同源基因以及外源基因共同受到抵制的现象称为共抑制(Napoli等，1990；Rjorgensen等，1995)。由于共抑制是发生在转录后水平上的，但mRNA不稳定，不积累，发生转录后的降解，导致基因不表达，所以共抑制又叫转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。该技术在矮牵牛(李艳，2001)、菊花(Gutterson等，1994)、蓝猪耳(Suzuki等，2000)等花卉的花色修饰方面已取得成功。
(3)外源目的基因导入。将欲修饰的供试株及其近缘种植物中原先不具有的一个(或几个)基因导入其中，从而使该受体植物增加一个(或几个)新的性状。即引入新基因来补偿某些品种缺乏合成某些颜色的能力。引入的新基因是一些色素合成的结构基因。
在菊花几千年的栽培过程中，用种间甚至是属间的杂交来获得新性状，并通过自交、回交等有性过程获得性状分离，估计至少有10个种参与了现代栽培菊花的形成(Ankerson，1967)。非整倍体和多倍体导致了高频的体细胞突变，而且很多突变可以通过无性繁殖传给后代。几乎可以说没有一种栽培花卉，象菊花这样具有如此复杂多样的遗传背景。因此在菊花中遗传育种的研究难度较大。
我国地被菊种质资源丰富，虽然长期以来的传统育种方法(自然或人工诱导突变体产生，或人工杂交等)也培育了一些优良的品种(系)，但是由于育种方式单一，育种理论相对贫瘠，至今为止，全世界还没有通过基因工程技术获得地被菊花的花色改变的转基因植株。

发明内容
本发明的目的是提供一种获得地被菊花花色改变转基因植株的方法。
本发明提供了一种根癌农杆菌介导的外源基因转化地被菊花的方法，它包括步骤(1)选择改变花色的外源基因；(2)构建载体，载体宿主为根癌农杆菌；(3)叶盘法转化地被菊化；(4)筛选转基因植株。
本发明所述方法，其中改变花色的外源基因为CHS基因。
本发明所述方法，其中载体质粒为pCAMBIA1301，含有标记基因潮霉素HPTII基因、CaMV35S启动的CHS正向基因；其中根癌农杆菌菌株为LBA4404。
本发明所述方法，其中叶盘法转化地被菊花包括步骤(1)制备含有载体的根癌农杆菌菌液，稀释至OD 0.5-0.6；(2)将地被菊花叶片剪成小块放在含稀释菌液的液体培养基中浸泡泡5～7min；(3)将侵染过的叶面近轴面向下在培养基上28℃暗培养2d；(4)将共培养后的叶片转移至含1mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、50mg/L潮霉素和500mg/L羧卞青霉素的MS培养基上，25℃光照培养，至长出愈伤组织，每20d换一次培养基；(5)当愈伤组织长至0.5cm左右时，移至含2mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA、50mg/L潮霉素和500mg/L羧卞青霉素的MS培养基上，诱导苗的分化；(6)当从愈伤组织中分化出可见的不定芽后，再将不定芽移入含500mg/L羧卞青霉素MS培养基，当苗长至一定高度后可移入沙土中培养，获得转基因菊花抗性植株。
本发明所述方法，其中筛选转基因植株采用的方法选自PCR检测法、PCR-Southorn检测法、Dig标记的Southern杂交检测法。
本发明所述方法，其中PCR检测方法包括步骤(1)提取转基因菊花抗性植株的总DNA；(2)PCR检测PCR反应的引物为质粒载体pCAMBIA1301上的潮霉素引物，上游引物5′CCT CTA GAA AAA TGG TGA CAG TCG AGG AGT ATCGT3′；下游引物5′ACG GAT CCA GCA ACA CTG TGG AGG ACAACA GT 3′；PCR的50ul反应体系
菊花抗性植株总DNA 5ul、10×buffer 5ul、2.5mM dNTp 2ul、20pM上游引物1ul、20pM下游引物1ul、10U Taq DNA聚合酶0.5ul、d2H2O35.5ul；PCR反应条件94℃ 4min，94℃ 30s，38℃ 1min，72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min保温；(3)将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶分离，选择扩增出810bp目的带的植株为转化了pCAMBIA1301质粒的转基因植株。
本发明所述方法，其中PCR-Southorn检测方法包括(1)按所述PCR检测方法进行检测；(2)将PCR扩增产物电泳后的凝胶碱变性后转移到尼龙膜上，以Dig标记的潮霉素抗性基因为探针进行杂交，特异扩增的条带能发生杂交，为转化植株；非特异扩增的条带不发生杂交，为非转化植株。
本发明所述方法，其中Dig标记的Southern杂交检测法包括步骤(1)菊花植物总DNA酶切，100ul酶切体系菊花植物总DNA76ul、buffer 10ul、BSA 5ul、XohI 6ul、Rnase 3ul；37℃酶切3h；(2)质粒的酶切，50ul酶切体系质粒DNA 20ul、Buffer 5ul、Rnase 1ul、XohI 3ul、d2H2o 21ul；37℃酶切3h；(3)切后的菊花植物总DNA，以酚-氯仿抽提一次，然后用2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶解于TE中备用；(4)0.8％的琼脂糖低电压电泳；(5)切去胶的左下角，用0.25mHCl溶泡；变性、中和；(6)DNA的虹吸转移，转移至zeta-Bobe膜上；(7)杂交液进行预杂交1-2h，42℃；(8)Dig标记的探针沸水变性10min，然后放入冰浴；(9)42℃杂交12-14h。
(10)洗膜，马来酸缓冲液中漂洗，封闭液孵育，在检测缓冲液中平衡，显色，将膜放入TE缓冲液中终止反应；能发生杂交，为转化植株。
本发明所述方法，其中制备Dig标记探针采用PCR法，PCR反应的引物为质粒载体pCAMBIA1301上的潮霉素引物，50ul PCR反应体系pCAMBIA1301质粒DNA 5ul、20m上游引物0.5ul、20pm下游引物0.5ul、tag DNA聚合酶0.25ul、2.5mmDig-dNTP 2ul、d2H2O 41.75ul；PCR反应条件强变性94℃ 6min，94℃ 30min，38℃ 1min，72℃ 2min，36个循环72℃，10min保温。
在菊花的转基因操作中，出现了大量的假阳性(escaprs)植株。假阳性的形成可能的原因有2个，一个是T-DNA侵入植物细胞后瞬时表达，非转化细胞逃出了选择压；另一个原因是形成了嵌合体，转化细胞给未转化细胞提供了逃出选择压的“盾片”，形成了假阳性。以往对菊花的转基因研究所用的选择压的浓度都比较低(Ledger等，1991；Lowe等，1993；Roeou等，1993；De Jong等，1994；Urban等，1994；Fulcai等，1995)，在低选择压时，假阳性的发生率都非常高，高达85.8％(Takatsu等，1998)，或更多。提高筛选抗生素的浓度，则面临的是愈伤组织难分化，不断死亡或只分化出小的不定芽不能长高和生根。将小的不定芽移出抗生素培养基后，分化出的植株假阳性比率过大，有的甚至全部为假阳性。针对这一问题，本实验采用高选择压，长时间多次筛选的方法，取得了较好的效果。
采用PCR的方式对转基因菊花植株做初步的筛选是有效的。因为PCR反应所需要的DNA量很小，可以用微量提取DNA的方法，可对大量的植株进行检测，这会在一定程度上减少工作量。PCR结果可直接用于Southern杂交，以快速、准确的分辨阳性和假阳性。但是这种方法的缺点在于它无法估计转入基因的拷贝数。
菊花的基因组较大，25pg/cell，因此Southern杂交的敏感性较差(Renou等，1994)，而且地被菊的植物细胞中多糖的含量较多，用xboI酶切的效果不十分理想，EcoRI和HindIII在相同条件下则可以很好的酶切菊花总DNA。但是在Southern杂交中我们仍然在810bp得到了清晰的杂交片段。
转基因植物是否能正常生长是育种者始终关心的问题。将转CHS基因植株与非转基因地被菊花苗生长进行比较，发现生长情况基本一致，均能够进行正常生长。方差分析结表明，转基因菊花与对照在株高(cm)、冠幅(cm)、节数、节间(cm)、叶长(cm)、叶宽(cm)、叶长/叶宽、花数、花径(cm)、重瓣性等方面差异均不显著，植株仍可以保持原有的优良性状。见图5，6。国外在对菊花品种‘Money maker’的转基因植株的研究中也发现，尽管其株高有很少量的降低，但总体的生长情况没有改变。

图1质粒pCAMBIA1301的T-DNA结构简图。
图2转CHS基因抗性植株的PCR检测结果图。
M，λDNA/HindIII+EcoRI分子量标准；1～8，转化了pCAMBIA1301质粒的转基因植株(扩增出810bp的目的带)。
图3转CHS基因抗性植株的PCR-Southorn检测结果图。
M，λDNA/Hind III+EcoRI分子量标准；1～11，转化了pCAMBIA1301质粒的转基因植株(扩增出810bp的目的带)；12，未转基因植株，作为负对照。
图4转CHS基因抗性植株的Southorn检测结果图。
M，λDNA/Hind III+EcoRI分子量标准；1～3，转化了pCAMBIA1301质粒的转基因植株(扩增出810bp的目的带)；4，未转基因植株，作为负对照。
图5转CHS基因植株(48)与未转基因的植株株高比较图6转CHS基因植株(48)与未转基因的植株节间、叶长、叶宽的比较具体实施方式
实施例1构建载体农杆菌菌株为LBA4404，质粒为pCAMBIA1301，含有潮霉素HPTII基因、CaMV35S启动的CHS正向基因，见图1。
实施例2叶盘法转化地被菊化(1)挑取农杆菌单菌落放入YEB液体培养基(5g/L胰化蛋白胨+1g/L酵母浸膏+5g/L牛肉浸膏+0.493g MgSO4，pH＝7.0)中(Kan50mg/L+Rif 60mg/L)28℃振荡培养h转接入相同的液体培养基，同样条件下培养4～5h，使菌处于对数生长期。
(2)4000rpm离心10min，用1/10ms培养液工无菌水重悬沉淀，稀释至OD0.5-0.6左右。
(3)将地被菊花叶片剪成小块放在稀释的菌液(YEB+Kan 50mg/L+Rif 60mg/L)中浸泡5～7min。用无菌滤纸吸干叶片表面过多的菌液。
(4)将侵染过的叶面近轴面向下，茎段水平放入MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA培养基上，28℃暗培养2d。
(5)将共培养后的叶片转移至MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+50mg/L潮霉素+500mg/L羧卞青霉素培养基上，25℃光照培养，至长出愈伤组织。每20d换一次培养基。
(6)当愈伤组织长至0.5cm左右时，移入MS+2mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+50mg/L潮霉素+500mg/L羧卞青霉素培养基，诱导苗的分化。
(7)当从愈伤组织中分化出可见的不定芽后，再将不定芽移入MS+500mg/L羧卞青霉素培养基。
(8)当苗长至一定高度后可移入沙土中培养。
实施例3转CHS基因菊花抗性植株PCR检测转CHS基因菊花抗性植株DNA的提取用CTAB法提取DNA。本法由Murray等人的方法改进而成。
(1)剪取根良好的植株顶端嫩叶，除去叶脉，置于研钵中。倒入液氮研磨，将约0.2g粉末分装入1.5ml离心管中，加入500ul×CTAB提取缓冲液，迅速混匀。
提取缓冲液2×CTAB buffer0.1mol/LTris·Cl(pH8.0)0.4mol/LNaCl20mol/L EDTA(pH8.0)20mol/L CTAB使用前加入1％(体积比)巯基乙醉。
(2)60-65℃水浴45min(3)在室温下用等体积氯仿抽提。
(4)温下12,000rpm离心10min吸取上清(注意tip要剪口，以防DNA断裂)。
(5)加入2倍体积无水乙醉在-20℃沉淀30min，离心，用预冷的70％乙醉洗涤沉淀，晾干。
(6)保持干燥状态贮存于-20℃冰箱。使用前用适量灭菌的d2H2O溶解沉淀，溶解后可保存于4℃冰箱，一周内可使用，质量不变。避免反复冻融。
植物总DNA可以用简易提取方法(1)剪取植物顶端嫩叶(面积小于0.5cm2)，放入1.5ml离心管中，加入200ul 2×CTAB缓冲液，用镊子或tip倒碎叶片。
(2)～(5)同上。
(6)于20ul d2H2O中，可取5ul作为PCR检测的模板。
此方法配合下面的PCR方法，可用于转基因植物及其后代的快速大规模检测。
PCR反应的引物为pCAMBIA1301上的潮霉素引物，上游引物5′CCT CTA GAA AAA TGG TGA CAG TCG AGG AGT ATC GT3′；下游引物5′ACG GAT CCA GCA ACA CTG TGG AGG ACA ACAGT 3′；50ul PCR的反应体系植物总DNA 5ul、10×buffer 5ul、2.5mMdNTP 2ul、上游引物(20pM)1ul、下游引物(20pM)1ul、TaqDNA聚合酶0.5ul(10U)、d2H2O 35.5ul；PCR反应条件94℃ 4min，94℃ 30s，38℃ 1min，72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min保温。
通过筛选培养，共获得93株转CHS基因的抗性植株。提取了其中的36株抗性植株的DNA，利用潮霉素的引物，进行PCR，扩增出长度为810bp片段，结果得到16个阳性株，部分PCR结果见图2。
实施例4转CHS基因菊花抗性植株PCR-Southorn检测将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶分离，然后用Dig标记的Southern杂交(见下述)。转膜和杂交时间均可适当缩短。
PCR的检测方法虽然快速，易于操作，但是会产生一定量的假阳性，即非特异性扩增，而将PCR扩增产物电泳后的凝胶碱变性后转移到尼龙膜上，以Dig标记潮霉素抗性基因为探针进行杂交，特异扩增的条带能发生杂交，非特异扩增的条带不发生杂交，以此检出非转化植株。通过PCR-Southern共检测了11个PCR阳性的植株，结果证实阳性率为73％，部分PCR-Southern结果见图3。
实施例5转CHS基因菊花抗性植株Dig标记的Southern杂交检测随机选取3个PCR-Southern阳性植株和野生型植株(未转基因植株)为对照，用Dig进行Southern杂交，酶切用xohI，将质粒上的潮霉素基因片段切下来，杂交的探针用潮霉素的引物，结果见图4。通过转化，共获得6株转CHS基因植株，编号依次为05，08，32，33，42，48。
(1)植物总DNA酶切酶切体系植物总DNA 76ulbuffer10ulBSA 5ulXohI 6ulRnase 3ulTotal 100ul(2)质粒的酶切质粒DNA 20ulBuffer 5ulRnase1ulXohI 3uld2H2o21ulTotal50ul37℃酶切3h。
(3)切后的植物总DNA，以酚-氯仿抽提一次，然后用2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶解于20ul的TE中备用。
(4)0.8％的醇脂糖低电压电泳。
(5)切掉胶的左下角，用0.25mHCl溶泡5min。
(6)d2H2O洗过后，用变性缓冲液侵泡15min×2。
(7)d2H2O洗过后用中和液和15min×2。
(8)DNA的虹吸转移，在盛有20×SSC的大培养皿上做滤纸桥，将胶置于其上，胶上覆zeta-Bobe膜。膜上放二层滤纸和15cm厚的吸水纸，上压500g重物，转移16-20hr80℃烤膜2h。
变性液0.5N NaOH，1.5MNaCl中和液3M NaCl，0.5Mtris-HCl(7.5)(9)杂交液进行预杂交1-2h，42℃。
(10)探针沸水变性10min，然后放入冰浴。
(11)42℃杂交12-14h。
杂交液50％Formamide5×SSC0.1％(W/V)N-Lauroylsarcosine0.02％(W/V)SDS2％封闭溶液(12)洗膜室温下用2×SSC，0.1％SDS洗两次，每次5min，然后在42℃下，用0.1×SSC，0.1％SDS洗两次，每次15min，轻轻搅动。
(13)洗膜后，将膜在马来酸缓冲液(0.1M Maleic acid，0.15MNaCl pH7.5)中漂洗3min，封闭液孵育30min。
封闭液，用马来酸缓冲液稀释10倍的BR。
(14)在封闭液中将anti-Dig-Ap按1∶5000稀释，作为抗体溶液，孵育30min。
(15)用马来酸缓冲液洗2次，每次15min。
(16)在检测缓冲液中平衡5min检测缓冲液100mm Tris-HCl(pH9.5)100mm NaCl，50mm MgCl2(17)将膜放入显色溶液，黑暗中保存。显色溶液，10ml检测缓冲液加入45ulNBT和35ul×phosphato(18)7～12h后，显色完成，将膜放入TE缓冲液中终止反应。
实施例6Southern探针的标记
Dig DNA探针标记采用PCR法反应体系质粒DNA 5ul上游引物(20m) 0.5ul下游引物(20pm) 0.5ultag DNA聚合酶 0.25ulDig-dnTp(2.5mm) 2uld2H2O 41.75ulTotal 50ul反应条件强变性94℃ 6min，94℃ 30min，38℃ 1min，72℃ 2min，36个循环72℃，10min保温Dig标记入DNA/HindIII反应体系入DNA/HindIII5.42ug/10ul5×labelling buffer 8ulBSA(10mg/L) 0.8ulDig-dNTp labelling Mix 2ulKlenon 3uld2H2O 16.2ulTotal 40ul37℃保温10h。
实验例1转CHS基因菊花植株的田间生长情况将转CHS基因植株(编号依次为05，08，32，33，42，48)与非转基因地被菊花苗生长进行比较，发现生长情况基本一致，均能够进行正常生长。方差分析结表明，转基因菊花与对照在株高(cm)、冠幅(cm)、节数、节间(cm)、叶长(cm)、叶宽(cm)、叶长/叶宽、花数、花径(cm)、重瓣性等方面差异均不显著，植株仍可以保持原有的优良性状。见图5，6。
权利要求
1.一种根癌农杆菌介导的外源基因转化地被菊花的方法，它包括步骤(1)选择改变花色的外源基因；(2)构建载体，载体宿主为根癌农杆菌；(3)叶盘法转化地被菊花；(4)筛选转基因植株。
2.根据权利要求1所述方法，其中改变花色的外源基因为CHS基因。
3.根据权利要求1所述方法，其中载体质粒为pCAMBIA1301，含有标记基因潮霉素基因、CaMV35S启动的CHS正向基因；其中根癌农杆菌菌株为LBA4404。
4.根据权利要求1所述方法，其中叶盘法转化地被菊花包括步骤(1)制备含有载体的根癌农杆菌菌液，稀释至OD值0.5-0.6；(2)将地被菊花叶片剪成小块放在含稀释菌液的液体培养基中浸泡泡5～7min；(3)将侵染过的叶面近轴面向下在培养基上28℃暗培养2d；(4)将共培养后的叶片转移至含1mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、50mg/L潮霉素和500mg/L羧卞青霉素的MS培养基上，25℃光照培养，至长出愈伤组织，每20d换一次培养基；(5)当愈伤组织长至0.5cm左右时，移至含2mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA、50mg/L潮霉素和500mg/L羧卞青霉素的MS培养基上，诱导苗的分化；(6)当从愈伤组织中分化出可见的不定芽后，再将不定芽移入含500mg/L羧卞青霉素MS培养基，当苗长至一定高度后可移入沙土中培养，获得转基因菊花抗性植株。
5.根据权利要求1所述方法，其中筛选转基因植株采用的方法选自PCR检测法、PCR-Southorn检测法、Dig标记的Southern杂交检测法。
6.根据权利要求5所述方法，其中PCR检测方法包括步骤(1)提取转基因菊花抗性植株的总DNA；(2)PCR检测PCR反应的引物为质粒载体pCAMBIA1301上的潮霉素引物，上游引物5′CCT CTA GAA AAA TGG TGA CAG TCG AGG AGT ATCGT3′；下游引物5′ACG GAT CCA GCA ACA CTG TGG AGG ACAACA GT3′；PCR的50ul反应体系菊花抗性植株总DNA 5ul、10×buffer 5ul、2.5mM dNTp 2ul、20pM上游引物1ul、20pM下游引物1ul、10U Taq DNA聚合酶0.5ul、d2H2O35.5ul；PCR反应条件94℃ 4min，94℃ 30s，38℃ 1min，72℃ 2min，30个循环，72℃ 10min保温；(3)将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶分离，选择扩增出810bp目的带的植株为转化了pCAMBIA1301质粒的转基因植株。
7.根据权利要求5所述方法，其中PCR-Southom检测方法包括(1)按权利要求6所述PCR检测方法进行检测；(2)将PCR扩增产物电泳后的凝胶碱变性后转移到尼龙膜上，以Dig标记的潮霉素基因为探针进行杂交，特异扩增的条带能发生杂交，为转化植株；非特异扩增的条带不发生杂交，为非转化植株。
8.根据权利要求5所述方法，其中Dig标记的Southern杂交检测法包括步骤(1)菊花植物总DNA酶切，100ul酶切体系菊花植物总DNA76ul、buffer 10ul、BSA 5ul、XohI 6ul、Rnase 3ul；37℃酶切3h；(2)质粒的酶切，50ul酶切体系质粒DNA 20ul、Buffer 5ul、Rnase 1ul、XohI 3ul、d2H2o 21ul；37℃酶切3h。(3)切后的菊花植物总DNA，以酚-氯仿抽提一次，然后用2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇洗涤沉淀，抽干后溶解于TE中备用；(4)0.8％的琼脂糖低电压电泳；(5)切去胶的左下角，用0.25mHCl溶泡；变性、中和；(6)DNA的虹吸转移，转移至zeta-Bobe膜上；(7)杂交液进行预杂交1-2h，42℃；(8)Dig标记的探针沸水变性10min，然后放入冰浴；(9)42℃杂交12-14h。(10)洗膜，马来酸缓冲液中漂洗，封闭液孵育，在检测缓冲液中平衡，显色，将膜放入TE缓冲液中终止反应；能发生杂交的为转化植株。
9.根据权利要求7或8所述方法，其中制备Dig标记探针采用PCR法，PCR反应的引物为质粒载体pCAMBIA1301上的潮霉素引物，50ul PCR反应体系pCAMBIA1301质粒DNA 5ul、20m上游引物0.5ul、20pm下游引物0.5ul、tag DNA聚合酶0.25ul、2.5mmDig-dNTP 2ul、d2H2O 41.75ul；PCR反应条件强变性94℃ 6min，94℃ 30min，38℃ 1min，72℃ 2min，36个循环72℃，10min保温。
全文摘要
利用根癌农杆菌介导法将CHS基因导入地被菊花，获得了抗性植株。经过PCR、PCR－Southern、Southern等分子生物学技术检测，获得了6株转基因植株。将转CHS基因植株(编号依次为05，08，32，33，42，48)与非转基因地被菊花苗生长进行比较，发现生长情况基本一致，株高(cm)、冠幅(cm)、节数、节间(cm)、叶长(cm)、叶宽(cm)、叶长/叶宽、花数、花径(cm)、重瓣性等方面差异均不显著，植株仍可以保持原有的优良性状。
文档编号C12N15/74GK1888070SQ20051001202
公开日2007年1月3日申请日期2005年6月28日优先权日2005年6月28日
发明者张启翔, 高亦珂, 吕晋慧, 蒋细旺, 吴月亮, 孙明申请人:北京林业大学