调节植物叶片转绿过程的蛋白、其编码基因及应用.pdf
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及调节植物叶片转绿过程的蛋白、其编码基因及应用。
背景技术
叶片是植物进行光合作用的重要器官，影响农作物的生物产量和经济产量。人工控制植物叶片颜色变化对快速改良或者培育新的园艺植物品种具有重要意义。
叶绿体是植物进行光合作用的场所，因此，延长叶绿体的功能对于提高生物产量或者经济产量具有重要的意义。另外，在园艺观赏植物中，观叶植物也是越来越受到人们的重视。目前，这些观赏植物都是从自然突变体或者通过人工诱变后筛选获得的突变体。随着生物技术的不断发展，通过转基因定向培育植物新品种显示出快速、效率高等特点。
但是，目前在植物中发现的控制叶片颜色变化的基因还为数不多。在拟南芥整个生育期中，到目前为止只有少数几个基因已被报道能控制叶片逐渐转绿。
因此，本领域还有必要进行深入的研究，以找到效果明显的可调控植物叶片颜色变化的基因，从而为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供良好的基因资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调节植物叶片调节植物叶片的颜色性状(如促进植物叶片的转绿)的蛋白、其编码基因及应用。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：
(a)如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述多肽的功能的由(a)衍生的多肽。
在一个优选例中，(a)所述多肽的功能是：调节植物叶片的颜色性状(如促进植物叶片的转绿)。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，所述的多核苷酸选自下组：
(a)编码所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在一个优选例中，所述的多核苷酸编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞：
含有所述的载体；或
基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞，获得培养物；
(b)从培养物中分离出所述的多肽。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于调节植物叶片的颜色性状。
在一个优选例中，所述的调节植物叶片的颜色性状是：调节(如促进)植物叶片的转绿。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科、蔷薇科、或十字花科。
在另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)：拟南芥、水稻、烟草、瓜果、蔬菜、油菜等。
在本发明的另一方面，提供一种制备转基因植物的方法，所述的方法包括：
(1)将所述的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
在一个优选例中，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的多核苷酸；
(s2)将植物细胞、组织、器官或种子与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
在本发明的另一方面，提供一种转基因的植物，其由所述的制备转基因植物的方法制备。
在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽或其编码基因的激动剂或拮抗剂。
在一个优选例中，所述的多肽的拮抗剂选自(但不限于)：抗所述多肽的抗体，干扰所述多肽的编码基因表达的干扰分子。
在另一优选例中，所述的多肽的拮抗剂是含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的干扰分子。
在本发明的另一方面，提供一种制备植物的方法，所述植物的叶片具有黄化(部分叶片黄化或全部叶片黄化)的性状，所述的方法包括：
降低植物中所述的多肽的表达量；或
使植物中所述的多肽不表达。
在一个优选例中，所述的方法包括：
(1)将干扰所述的多核苷酸表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
在另一优选例中，所述的干扰所述的多核苷酸表达的干扰分子是在植物体内形成microRNA的分子；优选的，所述的干扰分子含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种植物，所述的植物叶片具有黄化的性状，其由以下方法制备获得：降低植物中所述的多肽的表达量；或使植物中所述的多肽不表达。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了野生型拟南芥(WT)，突变型拟南芥(clpr4)，在突变型拟南芥中转化野生型的ClpR4基因后获得的转基因拟南芥(ClpR4 in clpr4)，在野生型拟南芥中转入干扰野生型拟南芥中ClpR4基因表达的干扰分子后获得的转基因拟南芥(Ami-clpr4)的表型。其中，箭头所指为黄色叶片。
图2显示了拟南芥AtClpR4-GFP融合蛋白定位于叶绿体中。
图3显示了野生型拟南芥以及AtClpR4功能缺失的突变型拟南芥的叶绿体超微结构。
图4显示了AtClpR4基因在拟南芥中表达的组织特异性分析。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究，找到一种新的基因——ClpR4基因，并且将之与植物的叶片转绿过程相关联，发现ClpR4基因的低表达或缺失表达使得植物对新生叶片转绿变慢(植物新生叶片黄化)。并且，本发明人还发现，ClpR4蛋白是一个定位于叶绿体中的蛋白水解酶。利用本发明的ClpR4基因可调节植物叶片颜色性状，调节植物光合作用效率。
如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的拟南芥(Arabidopsisthaliana)、禾本科的水稻、玉米、蔷薇科的樱桃，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的ClpR4蛋白”或“分离的ClpR4多肽”是指ClpR4蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化ClpR4蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。“AtClpR4蛋白”或“AtClpR4多肽”是指拟南芥的“ClpR4蛋白”或“ClpR4多肽”。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括ClpR4蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的ClpR4蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
任何一种ClpR4蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，ClpR4蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的ClpR4蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长ClpR4蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长ClpR4蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在本发明中，术语“ClpR4蛋白”指具有ClpR4蛋白活性的SEQ ID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有与ClpR4蛋白相同功能的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括ClpR4蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与ClpR4蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗ClpR4蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含ClpR4蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了ClpR4蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有ClpR4蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供ClpR4蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然ClpR4蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“ClpR4蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
氨基酸残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码本发明ClpR4蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ClpR4蛋白的多聚核苷酸。
应理解，虽然本发明的ClpR4基因优选获自拟南芥，但是获自其它植物的与拟南芥ClpR4基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
本发明的ClpR4蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ClpR4蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的ClpR4蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码ClpR4蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，ClpR4蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ClpR4蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得叶片颜色性状发生改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的ClpR4蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗ClpR4蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组ClpR4蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激ClpR4蛋白功能的多肽分子。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用ClpR4蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测ClpR4蛋白的转录产物。
本发明提供了所述的ClpR4蛋白的用途，用于调节植物叶片的颜色性状(如促进植物叶片转绿)；或用于筛选对于调节植物叶片的颜色性状有用的物质(即：所述物质通过调节ClpR4蛋白的表达来调节植物叶片的颜色性状)。作为一种优选方式，所述的ClpR4蛋白可用于促进植物叶片转绿或提高植物光合作用效率。比如，对于某些ClpR4蛋白表达低下的植物或植株，可通过制备该种植物或植株的ClpR4蛋白提高表达的转基因植株，来促进植物叶片转绿或提高植物光合作用效率，达到改良植物的目的。
所述的ClpR4蛋白还可用于制备促进植物叶片转绿或提高植物光合作用效率的组合物。
本发明还涉及ClpR4的激动剂或拮抗剂及其用途。由于ClpR4的激动剂或拮抗剂可调节ClpR4的表达和/或调节ClpR4的活性等，因此，所述的ClpR4的激动剂或拮抗剂也可通过对ClpR4的影响来调节植物叶片的颜色性状或调节植物光合作用效率，从而达到改良植物的目的。
任何可提高ClpR4蛋白的活性、提高ClpR4蛋白的稳定性、促进ClpR4蛋白的表达、延长ClpR4蛋白有效作用时间、或促进ClpR4的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于促进植物叶片转绿或提高植物光合作用效率的有效物质。任何可降低ClpR4蛋白的活性、降低ClpR4蛋白的稳定性、抑制ClpR4蛋白的表达、减少ClpR4蛋白有效作用时间、或降低ClpR4的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为ClpR4的拮抗剂，如抗所述ClpR4蛋白的抗体，干扰所述ClpR4蛋白的编码基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述的拮抗剂可用于制备叶片颜色性状改变的植物，如叶片黄化的植物。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。
本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中ClpR4基因或其同源基因的表达。
一方面，本发明提供了一种促进植物叶片转绿或提高植物光合作用效率的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达ClpR4蛋白。
另一方面，本发明还提供了一种制备叶片具有黄化性状的植物的方法，所述的方法包括：降低所述植物中ClpR4蛋白的表达(包括使ClpR4蛋白不表达或低表达)。
在得知了所述的ClpR4蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的ClpR4蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带ClpR4基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的ClpR4蛋白。
此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低ClpR4蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义ClpR4基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达ClpR4蛋白。
作为本发明的一种实施方式，将编码ClpR4蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述ClpR4蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达ClpR4蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达ClpR4蛋白的植物。
优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的ClpR4蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入ClpR4蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源ClpR4蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ClpR4蛋白的编码基因；
(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使ClpR4蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入ClpR4蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
其它增加ClpR4基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强ClpR4基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该ClpR4基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
优选的，提供了一种制备叶片具有黄化性状的植物的方法，包括：降低植物中ClpR4蛋白的表达量；或使植物中ClpR4蛋白不表达。更优选地，所述的方法包括：(1)将干扰ClpR4基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
其它抑制ClpR4基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了ClpR4基因或其同源基因的转基因植物；或者ClpR4蛋白表达量(包括低表达或不表达)降低的植物等。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
此外，本发明还涉及利用植物叶片转绿性状作为一种基因转化植株后代的追踪标记。此外，还可利用ClpR4基因相关的叶片转绿特性作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。
此外，本发明还提供筛选可调节植物叶片颜色性状或植物光合作用效率的潜在物质的方法。在得知了所述的ClpR4蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节植物叶片颜色性状或调节植物光合作用效率的潜在物质。
在本发明的一种优选方式中，提供一种筛选调节植物叶片颜色性状或植物光合作用效率的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达ClpR4蛋白的体系接触，检测候选物质对ClpR4蛋白的影响；若所述候选物质可提高或降低ClpR4蛋白的表达，或促进或抑制ClpR4蛋白的活性，则表明其是可用于调节调节植物叶片颜色性状或植物光合作用效率。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节植物叶片颜色性状或植物光合作用效率有用的物质。
因此，本发明还包括通过所述的筛选方法获得的物质，所述的物质可用于调节植物叶片颜色性状或植物光合作用效率。
在本发明的一个实例中，提供了一种获自拟南芥的ClpR4基因(AtClpR4)，该基因的基因组序列全长2681bp，cDNA序列全长918bp，编码305AA的一条多肽，所述的基因如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。其编码的蛋白如SEQ IDNO：3所示。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的基因调节植物叶片颜色性状的效果明显，为转基因技术改良农作物或者园艺植物提供了很好的基因资源。
(2)使用本发明的基因可以通过转基因技术提高作物的产量或者快速培育出植物叶片颜色性状改变(如叶片颜色变绿或黄化)的新品种。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、植物叶片转绿调控基因的鉴定
本发明人用0.2％(V/V)的甲基磺酸乙酯(EMS)诱变拟南芥野生型Col-0生态型(获自美国ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center))，经M2代筛选与M3代鉴定，获得一个稳定的叶色逐渐转绿株系(突变体)。与Col-0相比，突变体的新叶为黄色，而老叶则转为绿色，在整个生长过程中均如此，并且其叶缘呈锯齿型，植株生长速率相对较慢。
将野生型Col-0作为父本、突变体作为母本杂交得到的F1代或将突变体作为父本、野生型Col-0作为母本杂交得到的F1代，植株均同野生型一样，无叶片黄化表型，表明该基因为细胞核编码的隐性基因。播种从F1代植株上收获的种子得到F2代植株，在随机取的植株中，叶片逐步转绿植株与正常植株的比例为1比3，表明该基因为单位点隐性突变。
将该突变体与拟南芥野生型Ler生态型(获自美国ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center))杂交得到F1代，F1代自交获得F2代图位克隆群体，利用基于拟南芥DNA多态性数据库(http://www.arabidopsis.org/)中简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)的InDel标记对突变基因进行定位。随机选取60个突变植株抽提DNA，每30个突变体DNA混成一个DNA池，进行基因的BSA(分群分析法，Bulk segregate analysis)分析。用覆盖基因组的20对分子标记进行PCR扩增，同时扩增Col-0、Ler、F1的DNA作为对照，将突变基因初步定位在4号染色体下臂。然后扩大群体进行精细定位，检测到一个点突变，该突变位点位于ClpR4基因第二个内含子的第一个碱基，从而影响到RNA前体的剪切。在突变体中，可以检测到3个转录本，其中最小的一条的错误剪切导致多于野生型5个氨基酸，推测其可能会有部分功能。ClpR4蛋白是叶绿体Clp蛋白酶体的核心亚基之一，此复合体参与叶绿体蛋白的降解。ClpR4基因在各种组织与发育时期都能检测到表达。
AtClpR4基因编码区基因组(genomic DNA)序列如下(SEQ ID NO：1)：
(注明：小写斜体字为5’UTR，内含子和3’UTR，大写正体字为外显子序列(SEQ ID NO：2))
ATGGAGGTAGCAGCAGCGACTGCGACGAGCTTCACAACGCTTCGAGCTCGTACGTCAGCGATTATCCCGTCTTCTACACGTAATCTGAGATCTAAACCGAGATTTTCTTCATCTTCATCTCTCAGAGCTTCTCTTTCGAATGGCTTTCTTTCGCCGTATACCGGAGGAAGCATCTCTAGTGACTTATGCGGCGCTAAGCTTCGTGCGGAATCGCTTAATCCGTTAAATTTTTCCAGTTCCAAGCCTAAACGCGGAGTTGTCACTATGGTTATACCTTTCTCAAAGGGAAGTGCACACGAACAACCTCCTCCTGATTTGGCATCATATTTGTTCAAGAACCGAATTGTATATTTGGGAATGTCTCTCGTACCTTCAGTTACTGAGTTGATACTTGCGGAGTTTCTTTACCTTCAGTATGAAGACGAGGAAAAGCCTATTTACCTTTACATAAACTCGACTGGGACAACCAAGAATGGTGAAAAGTTGGGCTATGATACTGAGGCTTTTGCAATCTATGATGTCATGGGGTATGTCAAACCACCAATCTTTACTCTTTGCGTCGGGAATGCTTGGGGTGAAGCTGCTTTGCTTCTGACTGCTGGTGCAAAAGGAAATCGATCTGCGTTGCCCTCATCAACTATTATGATAAAGCAGCCCATTGCTCGATTTCAAGGCCAAGCAACTGATGTTGAAATTGCAAGGAAAGAAATCAAGCACATAA AGACAGAAATGGTCAAGCTGTATTCAAAGCATATTGGTAAATCCCCGGAGCAGATTGAAGCTGACATGAAACGCCCGAAATATTTTAGTCCCACTGAGGCTGTTGAATATGGGATCATTGATAAGGTGGTTTACAATGAAAGGGGCAGCCAAGACAGAGGAGTTGTGTCTGACCTTAAAAAGGCACAACTCATTTGA
AtClpR4蛋白序列如下(SEQ ID NO：3)：
MEVAAATATSFTTLRARTSAIIPSSTRNLRSKPRFSSSSSLRASLSNGFLSPYTGGSISSDLCGAKLRAESLNPLNFSSSKPKRGVVTMVIPFSKGSAHEQPPPDLASYLFKNRIVYLGMSLVPSVTELILAEFLYLQYEDEEKPIYLYINSTGTTKNGEKLGYDTEAFAIYDVMGYVKPPIFTLCVGNAWGEAALLLTAGAKGNRSALPSSTIMIKQPIARFQGQATDVEIARKEIKHIKTEMVKLYSKHIGKSPEQIEADMKRPKYFSPTEAVEYGIIDKVVYNERGSQDRGVVSDLKKAQLI
实施例2、拟南芥AtClpR4功能缺失的表型与遗传互补鉴定
1.遗传互补鉴定
为证实叶色逐步转绿的表型确实与ClpR4基因有关，本发明人进行了遗传互补分析。通过PCR扩增，克隆了它的全长cDNA，构建花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动的重组表达载体。
以5’-CACCATGGAGGTAGCAGCAGCGACT-3’(SEQ ID NO：5)和5’-AGTTCTGACATTCAAATGAGTTGTGC-3’(SEQ ID NO：6)为引物，从拟南芥野生型Col-0生态型的cDNA文库中PCR扩增获得ClpR4基因的全长cDNA，利用Getaway克隆系统导入pENTR/SD/D-TOPO克隆载体(购自Invitrogen公司)，测序正确后通过LR反应(LR CLONASE Enzyme Mix，购自Invitation公司)至表达载体PGWB2(Invitrogen)，获得重组表达质粒。将重组表达质粒常规方法转入农杆菌GV3101(购自Invitrogen)。
拟南芥转化采用喷洒法，将含有重组表达质粒的农杆菌均匀喷洒拟南芥，至叶片上有液滴落下，将植物避光过夜。之后将植物转移到正常条件下生长。7天后按上述方法重复转化1次。待种子成熟后将植株混合采收，在干燥器中放置7天。T1代种子消毒后播种在含有50μg/ml Kan的1/2×MS培养基上，4℃放置72h，然后正常光照培养。
结果，在实施例1获得的突变体植物中转化野生型的ClpR4基因后，获得了多个叶色转绿恢复的转基因株系，其表型见图1(ClpR4 in clpr4)。
2.功能缺失表型的建立
针对AtClpR4基因的序列特异性，根据WMD 2-Web MicroRNA Designer设计了产生人工microRNA(AmiRNA)的PCR引物如下：
MIR-VAR2-I miR-s(SEQ ID NO：7)：
5’-GaTAAACTCGGAAAGAATTGCGCtctctcttttgtattcc-3’；
MIR-VAR2-II miR-a(SEQ ID NO：8)：
5’-GaGCGCAATTCTTTCCGAGTTTAtcaaagagaatcaatga-3’；
MIR-VAR2-III miR*s(SEQ ID NO：9)：
5’-GaGCACAATTCTTTCGGAGTTTTtcacaggtcgtgatatg-3’；
MIR-VAR2-IV miR*a(SEQ ID NO：10)：
5’-GaAAAACTCCGAAAGAATTGTGCtctacatatatattcct-3’。
通过对出发质粒pRS300(Tübingen University，Germany)的PCR突变(参见Tübingen University提供的使用说明书，或The Plant Cell，Vol.18，1121-1133，May 2006提供的方法)，获得了含针对AtClpR4的人工回文序列的片段，然后用A、B引物扩增出含有ClpR4靶向序列的片段克隆到pENTR/SD/D-TOPO载体，LR反应至表达载体PGWB2。
A引物(SEQ ID NO：11)：
5’-CACCCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’；
B引物(SEQ ID NO：12)：
5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’。
将上述载体通过农杆菌转化野生型Col-0生态型，结果获得了多个叶片转绿明显变慢的转基因T1株系，其表型见图1(Ami-clpr4)，其新生叶片显示黄色。
其中，ClpR4 Target microRNA的特异性序列为(SEQ ID NO：4)：
5’-TAATCGCTGACGTACGAGGTC-3’。
实施例3、拟南芥AtClpR4-GFP融合蛋白定位于叶绿体中
本发明人用前述的方法克隆AtClpR4不含终止子的全长cDNA到pENTR/SD/D-TOPO载体，引物序列为5’-CACCATGGAGGTAGCAGCAGCGAC T-3’(SEQ ID NO：5)和5’-AATGAGTTGTGCCTTTTTAAGGTCAG(SEQ ID NO：13)-3’，LR反应至PGWB5表达载体。将此融合表达载体通过农杆菌转化野生型Col-0生态型。
转化ClpR4-GPF的阳性植株后代5天的小苗用于观察亚细胞定位，GFP荧光通过激光共聚焦扫描显微镜(FITC488，Zeiss LSM500)观察。GFP荧光检测激发波长为488nm，发射波长为505至545nm。叶绿素自发荧光检测激发波长为488nm，发射波长为585nm。
结果如图2所示，可见拟南芥AtClpR4-GFP融合蛋白定位于叶绿体中。
实施例4、拟南芥AtClpR4功能缺失对叶绿体超微结构的影响
利用透射电镜对野生型Col-0和突变体拟南芥的叶绿体进行观察，Col-0的叶绿体可以观察到完整的双层膜结构，以及内部相互连接的基粒与间质类囊体；来自突变体拟南芥外周(ClpR4 outer)叶色正常叶片的叶绿体超微结构与野生型没有明显区别，但来自内周(ClpR4 inner)黄色叶片的叶绿体发育有缺陷，叶绿体变小。见图3。
实施例5、AtClpR4基因表达的组织特异性
为了了解AtClpR4基因表达的特点，本发明人分别检测了抽薹时期植株中的根、茎、茎生叶、花及果荚等组织中的基因转录水平。另外，还对不同生长时期(10天、30天、60天)的植株叶片进行了分析，其中生长60天的植物叶片被分成外周和内周叶片两组。
常规方法提取样品中的RNA，并常规方法制备cDNA文库。基因表达的检测通过设计基因特异性引物：
ClpR4-RT-F(SEQ ID NO：14)：5’-TCAGCGATTATCCCGTCTTCTAC-3’；
ClpR4-RT-R(SEQ ID NO：15)：5’-AGCCTCAGTATCATAGCCCAAC-3’。
经PCR扩增基因产物，然后由琼脂糖凝胶电泳分离，图像分析通过GIS-2010(天能)进行。将Actin的表达水平作为内标，为了预防DNA污染，同时将基因组的DNA作为目的带扩增对照。
结果见图4。实验结果表明：ClpR4在地上部组织中的表达水平比地下根中的表达明显要高。但是，地上部各组织之间的表达量没有很大的差异。
实施例6、AtClpR4基因的变异基因及其功能
重复实施例2中第1部分，不同点在于额外地对实施例2中第1部分中获得的重组质粒进行定点诱变，其中所含有的外源cDNA序列即SEQ ID NO：2序列中第910位由c变为a(从而使得第304位氨基酸由Leu变为Ile)的基因，构成可表达AtClpR4基因的变异基因Mut.1的重组质粒。将该重组质粒转化农杆菌并喷洒实施例1获得的突变体拟南芥，制备后代转基因植物。
观察上述获得的转基因植物的叶片性状，结果发现，所获得的转基因植物的叶片转绿情况与野生型植物相同。
本发明人在拟南芥AtClpR4基因功能研究过程中发现，基因下调及上调植株表型明显，性征可以遗传。并且，对ClpR4基因的调节作用还可用于其它植物例如水稻、烟草、蔬菜、油菜等的叶片颜色调控。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>调节植物叶片转绿过程的蛋白、其编码基因及应用
<130>092439
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2681
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
agatcgttat cgtttcgggg tcacagggac tttcactctt tctctctctc tgcaacaaag 60
aagaaatgga ggtagcagca gcgactgcga cgagcttcac aacgcttcga gctcgtacgt 120
cagcgattat cccgtcttct acacgtaatc tgagatctaa accgagattt tcttcatctt 180
catctctcag agcttctctt tcgaatggct ttctttcgcc gtataccgga ggaagcatct 240
ctagtgactt atgcggcgct aagcttcgtg cggaatcgct taatccgtta aatttttcca 300
gttccaagcc taaacgcgga gttgtcacta tggtactcga atttatactt tttttcagtt 360
tcttaattaa cgagctccct attctgttag gattttgaaa ttgaggtttt cgttgctata 420
gctgagattt atgcttctgt ggtagtgaat tttcagaaat tgtatttgtc gagaaatggt 480
gttccttagt tttgaaccaa tggattagat tgactctaga tataggctat tagattgcaa 540
gggggagtaa tgctcattca ttctatagct gagatttatg cttctgtggt ggtgaattga 600
gggaaaattt atgggtcgaa tcttaccaac ggttgctact tagctttaaa cggcgaatta 660
atggattaga gttactattg atatatgcaa ttagatagca aagacggctc attcatttct 720
gttgtttaat tgatcggaaa tggtacatgt ttagttagag agttgagtat gaagattaaa 780
taatgcagtt tcggaagaaa ttatgctgtg tgtttggctg gtaaggaaga agttgagtta 840
ttatgtggca gaggtttcac ttgattgtgt gtgccactta taatatgcat caattgctct 900
gattatgatt atgatagaga atttggaggc tgctatattc ttcacatata gtcttttgtt 960
tattgttgtt attatatgat tcttatcttc gtgcttccgt cttatcaaca ggttatacct 1020
ttctcaaagg gaagtgcaca cgaacaacct cctcctgatt tggcatcata tttgttcaag 1080
aaccgaattg tatatttggg aatgtctctc gtaccttcag ttactgagtt gatacttgcg 1140
gagtttcttt accttcagta tgaagacgag gaaaagccta tttaccttta cataaactcg 1200
actgggacaa ccaaggtggg cttccattat gtagtccatc atattaagaa cgcatactga 1260
atagtaaaat tgaaactgtg gtttgtttca aatgaatgac taaaagctta gaaatcatta 1320
cctatcgttc aaactgtttt taagagaatt tatcttctcc cttttcagaa tggtgaaaag 1380
ttgggctatg atactgaggc ttttgcaatc tatgatgtca tggggtaatt gatcttcatc 1440
tctttcctca acttacttct tcccgtaata gcatcgataa caagacttgg atacttaaac 1500
tgctttccca aatattcaaa attgcacttg gagacagttt tcatatccag catattttgg 1560
ggagaacgac caattatcaa tgcaacaatc aactcttacc ttatctttga atttcaggta 1620
tgtcaaacca ccaatcttta ctctttgcgt cgggaatgct tggggtgaag ctgctttgct 1680
tctgactgct ggtgcaaaag gaaatcgatc tgcgttgccc tcatcaacta ttatgataaa 1740
gcaggttctt tctgatcgtt tcttttaaat attaggtggc gtcttttccc cctgctagaa 1800
gattttggtt ttctttttca agttggaaga atctaaggtt tatgattctt aattctgtgc 1860
atgcaccttt ttacttatca atatattttc tcttgcatgt taactttgta gcccattgct 1920
cgatttcaag gccaagcaac tgatgttgaa attgcaagga aagaaatcaa gcacataaag 1980
acagaaatgg tgagaagata aacttgatat gaattcacat agtagagaat caaacccttg 2040
tgatgtacgt agaatatctt agtttgatct tcattatgca acagtgtcca gttgtgtgtg 2100
ttatttgggt cttttaaggg ggagatataa ataaatggaa cttgcaggca atgggtgtat 2160
atacttgcag acatcttaat attcatcagt tagccattaa tagtatgcac atgctagcaa 2220
atctcaaatc atgctatcat tctctgtccg caacttttca cttttacctt caaacttatc 2280
tgaaagatgt gtctctattc tatgtaatgt tatgctcaag gtcaagctgt attcaaagca 2340
tattggtaaa tccccggagc agattgaagc tgacatgaaa cgcccgaaat attttagtcc 2400
cactgaggct gttgaatatg ggatcattga taaggtacga taaaatgtca gaaaaatccg 2460
taaaacgtat gagcgatttt gttttcctgt caacatagag ttattatctt ctgcatgatt 2520
gaatcattct ctttctgtaa tctgtgtgca ggtggtttac aatgaaaggg gcagccaaga 2580
cagaggagtt gtgtctgacc ttaaaaaggc acaactcatt tgaatgtcag aactgtcttc 2640
cgaaatccca tgattaacag gtaaaagcta aaatttgctc a 2681
<210>2
<211>918
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<221>外显子
<222>(1)..(918)
<400>2
atggaggtag cagcagcgac tgcgacgagc ttcacaacgc ttcgagctcg tacgtcagcg 60
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ctcagagctt ctctttcgaa tggctttctt tcgccgtata ccggaggaag catctctagt 180
gacttatgcg gcgctaagct tcgtgcggaa tcgcttaatc cgttaaattt ttccagttcc 240
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caacctcctc ctgatttggc atcatatttg ttcaagaacc gaattgtata tttgggaatg 360
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aagacagaaa tggtcaagct gtattcaaag catattggta aatccccgga gcagattgaa 780
gctgacatga aacgcccgaa atattttagt cccactgagg ctgttgaata tgggatcatt 840
gataaggtgg tttacaatga aaggggcagc caagacagag gagttgtgtc tgaccttaaa 900
aaggcacaac tcatttga 918
<210>3
<211>305
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>3
Met Glu Val Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Leu Arg Ala
1 5 10 15
Arg Thr Ser Ala Ile Ile Pro Ser Ser Thr Arg Asn Leu Arg Ser Lys
20 25 30
Pro Arg Phe Ser Ser Ser Ser Ser Leu Arg Ala Ser Leu Ser Asn Gly
35 40 45
Phe Leu Ser Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asp Leu Cys Gly
50 55 60
Ala Lys Leu Arg Ala Glu Ser Leu Asn Pro Leu Asn Phe Ser Ser Ser
65 70 75 80
Lys Pro Lys Arg Gly Val Val Thr Met Val Ile Pro Phe Ser Lys Gly
85 90 95
Ser Ala His Glu Gln Pro Pro Pro Asp Leu Ala Ser Tyr Leu Phe Lys
100 105 110
Asn Arg Ile Val Tyr Leu Gly Met Ser Leu Val Pro Ser Val Thr Glu
115 120 125
Leu Ile Leu Ala Glu Phe Leu Tyr Leu Gln Tyr Glu Asp Glu Glu Lys
130 135 140
Pro Ile Tyr Leu Tyr Ile Asn Ser Thr Gly Thr Thr Lys Asn Gly Glu
145 150 155 160
Lys Leu Gly Tyr Asp Thr Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Asp Val Met Gly
165 170 175
Tyr Val Lys Pro Pro Ile Phe Thr Leu Cys Val Gly Asn Ala Trp Gly
180 185 190
Glu Ala Ala Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ala Lys Gly Asn Arg Ser Ala
195 200 205
Leu Pro Ser Ser Thr Ile Met Ile Lys Gln Pro Ile Ala Arg Phe Gln
210 215 220
Gly Gln Ala Thr Asp Val Glu Ile Ala Arg Lys Glu Ile Lys His Ile
225 230 235 240
Lys Thr Glu Met Val Lys Leu Tyr Ser Lys His Ile Gly Lys Ser Pro
245 250 255
Glu Gln Ile Glu Ala Asp Met Lys Arg Pro Lys Tyr Phe Ser Pro Thr
260 265 270
Glu Ala Val Glu Tyr Gly Ile Ile Asp Lys Val Val Tyr Asn Glu Arg
275 280 285
Gly Ser Gln Asp Arg Gly Val Val Ser Asp Leu Lys Lys Ala Gln Leu
290 295 300
Ile
305
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>寡核苷酸
<400>4
taatcgctga cgtacgaggt c 21
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
caccatggag gtagcagcag cgact 25
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
agttctgaca ttcaaatgag ttgtgc 26
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
gataaactcg gaaagaattg cgctctctct tttgtattcc 40
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<211>40
<212>DNA
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<223>引物
<400>8
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<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
gagcacaatt ctttcggagt ttttcacagg tcgtgatatg 40
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<211>40
<212>DNA
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<221>misc_feature
<223>引物
<400>10
gaaaaactcc gaaagaattg tgctctacat atatattcct 40
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>11
caccctgcaa ggcgattaag ttgggtaac 29
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>12
gcggataaca atttcacaca ggaaacag 28
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>13
aatgagttgt gcctttttaa ggtcag 26
<210>14
<211>23
<212>DNA
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<221>misc_feature
<223>引物
<400>14
tcagcgatta tcccgtcttc tac 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<221>misc_feature
<223>引物
<400>15
agcctcagta tcatagccca ac 22
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