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一种基于发根农杆菌介导的草莓转基因方法

花匠小妙招
2025-05-10 02:00

一种基于发根农杆菌介导的草莓转基因方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及植物转基因技术，主要涉及一种基于发根农杆菌介导的草莓转基因方法。
【背景技术】
[0002] 草莓是蔷薇科（Rosaccae)草莓属（Fragaria)宿根性多年生草本果树。目前国内对草莓的研宄多集中在生理生化方面，而对于基因挖掘与功能分析的报道较少；其次，对草莓的果实研宄较多如果实着色等，而对草莓的根系研宄较少。此外，森林草莓（Fragaria vesca)基因组已测序完成，且已进行基因注释，这对挖掘控制重要性状的功能基因具有重要意义。目前缺少一套稳定高效的转基因体系，已经成为制约草莓分子生物学研宄的瓶颈。
[0003]根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)均是革兰氏阴性土壤细菌，分别应用其Ti质粒和Ri质粒侵染植物伤口进入细胞，并将其上含有的一段T-DNA插入到植物基因组中（Zhou, 2010 ;Cheng，2011)，发根农杆菌Ri质粒的T-DNA上有rolA-D基因群，T-DNA有tms基因，能诱发被感染植物的受伤部位产生大量的毛状根，且Ri质粒T-DNA上的基因不影响植株的再生，转化效率高，目前已在甘草（GlycyrrhizauralensisFisch.)、烟草（NicotianatabacumL.)等中获得成功。发根农杆菌诱导的毛状根属于激素自养型，具有有效成分含量高、生理生化和遗传性稳定、易于进行操作控制等特点，且所诱导的毛状根可从形态水平上鉴定，根多丛生、多分枝、多根毛，且无向地性，这些都可与未转化的根区别开。
[0004] 目前，草莓转基因还未见报道，因此，对于草莓的遗传改良和基因挖掘与功能分析，建立一套农杆菌介导的、高效稳定的转基因技术是很必要的。本发明的目的在于利用发根农杆菌建立森林草莓毛状根诱导体系，从而提供一种基于发根农杆菌介导的转基因方法。

【发明内容】

[0005] 本发明可以提供一种发根农杆菌介导的转基因方法，获得森林草莓毛状根。
[0006] 本发明所提出的技术方案包括以下步骤：
[0007] (1)制备草莓无菌苗；
[0008] (2)发根农杆菌活化，将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，以获得单菌落，挑取单菌落于LB液体培养基上，经暗培养；
[0009] (3)侵染外植体，将草莓无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌，然后将其放在共培养基上，经光照培养；
[0010] (4)共培养；
[0011] (5)发根培养；
[0012] (6)荧光检测。
[0013] 进一步地，其中所述的发根农杆菌为MSU440,载体上具35S: :DsRed报告基因。
[0014] 进一步地，其中步骤（2)中LB固体培养基或者LB液体培养基含50?lOOmg/L壮观霉素（spectinomycin) 〇
[0015] 进一步地，其中步骤（2)中将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，经28±2°C暗处倒置培养48-72h后获得单菌落。
[0016] 进一步地，其中步骤（2)中所述的暗培养系经28±2°C、摇床转速200±20rpm暗培养 48h。
[0017] 进一步地，其中步骤（3)还包括将侵染后的草莓无菌苗胚根放在铺有1/2无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口 2/3。
[0018] 进一步地，其中步骤（4)的共培养系经21±2°C光照16h、暗培养8h，如此反复培养 5d〇
[0019] 进一步地，其中步骤（1)包括森林草莓种子，冷处理，4°C冰箱保存7天；种子消毒：75%乙醇处理5min，1 %的NaCIO再处理5min，无菌蒸馏水冲洗2-3次；接种于MS基上，暗培养10天。
[0020] 进一步地，其中步骤（5)的继代培养包括将浸染后的外植体从共培养培养基上更换到发根培养基上，Parafilm膜全封口，24°C?25°C光照16h，暗培养8h，如此反复培养 25d，每周更换一次培养基。
[0021] 进一步地，其中步骤（6)包括采用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察。
[0022] 本发明通过发根农杆菌介导的转基因技术，可在短时间内（1个半月）得到毛状根，节约研宄时间，并且转化效率较高，可达到70%左右（阳性植株总数占总侵染外植体植株总数的百分比）。
【具体实施方式】
[0023] 现在结合具体实施例，进一步对本发明各步骤进行详细描述：
[0024] 1、含35S::DsRed报告体系的表达载体MSU440发根农杆菌：由瓦赫宁根大学Ton Bisseling课题组馈赠。
[0025] 2、森林草莓种子，冷处理，4°C冰箱保存7天；种子消毒：75%乙醇处理5min，l%的次氯酸钠NaCIO再处理5min，无菌蒸馏水冲洗2-3次；接种于MS基上，暗培养10天。
[0026] 3、发根农杆菌的活化：将发根农杆菌在含50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上划线，28°C暗处倒置培养48-72h后获得单菌落，挑取单菌落于新鲜含50mg/L壮观霉素 (spectinomycin)LB液体培养基上，28°C220rpm暗培养48h。吸取菌液再次涂布于含50mg/ L壮观霉素（spectinomycin)的LB固体培养基上，48-72h后用于侵染外植体。
[0027] 4、侵染外植体：先将森林草莓无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌MSU440,然后将其放在有铺有1/2无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口 2/3。
[0028] 5、共培养：21±1°C光照16小时、暗培养8h，如此反复培养5d。
[0029] 6、发根培养：更换到发根培养基上，方法同步骤（4)，Parafilm膜全封口，24°C? 25°C光照16小时、暗培养8h，如此反复，培养25d，每周更换一次培养基。
[0030] 7、荧光检测：利用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察，结果表明：转 35S: :DsRed植株根系可见整条根均有较强红色荧光。
[0031] 本发明中主要培养基及试剂如下，其中LB培养基溶解后不调pH值：
[0032] 木本植物基础培养基（MS培养基）：MS+1 %蔗糖+0. 9 %琼脂
[0033] 共培养培养基：g/L(参见表1)
[0034]表1
【主权项】
1. 一种发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备草莓无菌苗； (2) 发根农杆菌活化，将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，以获得单菌落，挑取单菌落于LB液体培养基上，经暗培养； (3) 侵染外植体，将板栗无菌苗下胚轴切除，在伤口处涂抹已活化的发根农杆菌，然后将其放在共培养基上，经光照培养； (4) 共培养； (5 )发根培养； (6)荧光检测。
2. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中所述的发根农杆菌为MSU440,载体上具35S :艮告基因。
3. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中所述的LB固体培养基或者LB液体培养基含50?100mg/L壮观霉素（spectinomycin)。
4. 根据权利要求1或3中所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中将发根农杆菌在LB固体培养基上划线，经28±2°C暗处倒置培养48 - 72h后获得单菌落。
5. 根据权利要求1或3中所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中所述的暗培养系经28±2°C、摇床转速200±20rpm暗培养48h。
6. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中步骤（3)将侵染后的草莓无菌苗胚根放在铺有1/2无菌滤纸的共培养培养基上，Parafilm膜封口 2/3。
7. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中步骤（4)的共培养系经21±2°C光照16h、暗培养8h，如此反复培养5d。
8. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中步骤（1)包括森林草莓种子，冷处理，4°C冰箱保存7天；种子消毒：75%乙醇处理5min，1%的NaCIO再处理 5min,无菌蒸馏水冲洗2-3次；接种于MS基上，暗培养10天。
9. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中步骤（5)的发根培养包括将浸染后的外植体从共培养培养基上更换到发根培养基上，Parafilm膜全封口， 24°C?25°C光照16h，暗培养8h,如此反复培养25d，每周更换一次培养基。
10. 根据权利要求1所述的发根农杆菌介导的草莓转基因方法，其中步骤（6)包括采用体视荧光显微镜对共转化植株进行荧光观察。
【专利摘要】本发明提出了一种基于发根农杆菌介导的草莓转基因方法，利用含35S：：DsRed报告基因的发根农杆菌MSU440侵染森林草莓无菌苗下胚轴，获得共转化植株，进而得到转化毛状根。采用本发明提出的草莓下胚轴转化方法不仅可以大大缩短转化周期（1个半月），实验结果也很直观。草莓离体毛状根体系为草莓基因功能验证提供了一种快速可靠的方法。
【IPC分类】C12N15-84, A01H5-06
【公开号】CN104593410
【申请号】CN201510003996
【发明人】邢宇, 曹庆芹, 赵晨晨, 秦岭, 张卿, 杨柳
【申请人】北京农学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月5日