一种控制棉花有限果枝性状的DB基因及其编码蛋白和应用.pdf
技术领域
本发明属于棉花基因技术领域，具体涉及一种控制棉花有限果枝性状的DB基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是蛋白、油脂的重要来源。正是因为棉花纤维和种子与人类生活密切相关，成为世界上重要的经济作物之一。全球棉花产值500多亿美元，种植面积约4.9亿亩。中国、印度、美国等五国占总产的70％以上，其中美、澳等先进植棉国家，实现了全程机械化，国际竞争力强，引领棉花发展方向。我国是世界上最大的棉花生产国、消费国和纺织品出口国。棉花不仅是我国近2亿棉农的重要经济来源，而且关系到1900万纺织及相关行业从业人员的就业问题，关系到国民经济稳定及棉纺工业发展。随着我国人力成本的不断攀升，棉花种植效益逐渐下降，改变棉花的种植方式将可以最大程度的提高棉花种植效益。由于棉花无限生长的特性，生长期较长，不同棉铃成熟期不一致，导致了棉花生产的用工较多和难以全程机械化，改变棉花无限生长的特性和缩短棉花的生育期，将可以改变棉花的种植方式，促进全程机械化进程，提高植棉效益。
棉花株型结构和早熟性对产量具有较大影响。目前生产上应用的大部分陆地棉品种为无限果枝类型，果枝包含多个果节，可以无限生长；棉花有限果枝突变体通常也叫作零式果枝，零式果枝突变体在海岛棉中通常表现花芽直接分化于主茎叶腋处，而在陆地棉中零式果枝材料的果枝通常为一节有限生长，顶端以2～3朵花结束，具有早熟、株型紧凑、花期集中的特点。因此，零式果枝突变对研究果枝发育，调控株型结构，使棉花株型紧凑，更加适于高密度种植和适于机采等具有重要的理论和实践意义。但是现有技术中并没有任何关于控制棉花株型结构和早熟性状的基因的报道，因此，目前还无法实现人工控制棉花株型和人工提高产量性状。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种控制棉花有限果枝性状的DB基因及其编码蛋白和应用，所述有限果枝DB基因有效果控制棉花株型结构和早熟性状，为棉花新品种培育和棉花生产提供了新的发展方向。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种棉花有限果枝DB基因，所述基因的核苷酸如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种所述棉花有限果枝DB基因的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种棉花有限果枝的编码蛋白，由所述编码序列翻译得到，所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
本发明提供了所述DB基因、所述的编码序列或所述编码蛋白在调控棉花果枝的类型中的应用。
本发明提供了所述DB基因、所述的编码序列、所述重组载体、所述重组菌、所述转基因细胞系或所述编码蛋白在培育有限果枝类型的棉花品种中的应用。
本发明提供了所述DB基因、所述的编码序列或所述编码蛋白在培育提早开花棉花品种中的应用。
本发明提供了一种棉花有限果枝DB基因，所述基因的核苷酸如序列表SEQ ID No.1所示。本发明提供的棉花有限果枝DB基因与野生型无限果枝类型棉花的DB基因相比，存在第313位核苷酸突变，由胞嘧啶G突变为胸腺嘧啶A，对应的氨基酸序列在第73位由天冬氨酸突变为天冬酰胺，所述DB基因具有控制有限果枝性状的生物学功能。所述棉花有限果枝DB基因序列长度为1013bp，所述DB基因包括4个外显子和间隔在4个外显子的3个内含子，所述突变发生在第2号外显子上。本发明提供的棉花有限果枝DB基因导入棉花中，使转基因棉花的表型从无限果枝类型变为有限果枝类型。
同时，本发明提供的棉花有限果枝DB基因还能有效提高棉花开花时间，实验证明，含有所述DB基因的转基因较无限果枝棉花相比，花期提前了7～10d。可见，本发明提供的棉花有限果枝DB基因对提前棉花开花时间有生物学作用。由于提前棉花开花时间对后期棉桃成熟有很大帮助，进而使棉花早熟，缩短棉花生产周期，为棉花生产和培育新的品种提供新方向。
附图说明
图1为本发明提供的棉花有限果枝DB基因的外显子示意图；
图2为GhNB基因的编码蛋白质序列示意图；
图3为实施例1中标记效果的电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种控制棉花有限果枝性状的DB基因，所述基因的核苷酸如序列表SEQ IDNo.1所示。
在本发明中，所述有限果枝DB基因序列长度为1013bp，所述DB基因包括4个外显子和间隔在4个外显子的3个内含子，与野生型无限果枝类型棉花的DB基因相比，存在第313位核苷酸突变，由G突变为A，所述突变发生在第1号外显子上(见图1)。
在本发明中，所述有限果枝DB基因与拟南芥TFL1/ATC基因是同源基因，同属于PEBP基因家族。
在本发明中，所述有限果枝DB基因的扩增方法采用普通PCR法进行，得到有限果枝DB基因片段。用于所述有限果枝DB基因的扩增引物包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。所述有限果枝DB基因的扩增是以有限果枝海岛棉材料(新海18)的基因组DNA为模板扩增。所述扩增的程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃30～34s；72℃5min。
本发明提供了一种所述棉花有限果枝DB基因的编码序列(CDS)，所述编码序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。所述CDS的全长为525bp。所述CDS的扩增方法优选采用上述用于所述有限果枝DB基因的扩增引物对以有限果枝海岛棉材料(新海18)的cDNA为模板扩增。所述扩增程序同DB基因扩增。
本发明提供了一种棉花有限果枝的编码蛋白，由所述编码序列翻译得到，所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。所述编码蛋白包括174个氨基酸。
在本发明中，所述编码蛋白的制备方法优选采用重组蛋白诱导表达和纯化的方法获得。所述重组蛋白诱导表达的方法优选将上述方案制备的重组载体导入原核生物中诱导表达。本发明对所述诱导表达的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的诱导表达的方案即可。诱导表达后，本发明将得到表达液进行纯化。所述纯化的方案采用本领域所熟知的纯化方案即可。
本发明提供了所述DB基因、所述的编码序列或所述编码蛋白在培育有限果枝类型的棉花品种中的应用。在本发明中，采用所述DB基因、所述的编码序列培育有限果枝类型的棉花品种的方法，优选采用常规杂交法即可。
本发明提供了所述DB基因、所述的编码序列或所述编码蛋白在培育提早开花棉花品种中的应用。所述培育的方法同上，在此不做赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种控制棉花有限果枝性状的DB基因及其编码蛋白和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
提取海岛棉有限果枝材料新海18的基因组DNA，所述有限果枝DB基因的扩增方法采用普通PCR法进行，得到有限果枝DB基因片段。用于所述有限果枝DB基因的扩增引物包括正向引物和反向引物；F：ATGGCAAAACTGTCAGATCC(SEQ ID No.4)；R：TTAGCGTCTTCTAGCAGCTGT(SEQ ID No.5)所述有限果枝DB基因的扩增是以海岛棉有限果枝材料新海18的基因组DNA为模板扩增。所述扩增的程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃30～34s；72℃5min。
将海岛棉有限果枝材料新海18与陆地棉品种中棉所100杂交，F1与中棉所43回交，BC1F1代采用DB基因功能性标记进行分子标记辅助选择，DB基因功能性标记引物其为核苷酸序列如下：
正向引物5’-CAGATGCCACATTTGGTAAG-3’(SEQ ID No.6)
反向引物5’-CTGTGGATCCCTATGTTAGA-3’(SEQ ID No.7)。
所选单株与中棉所100继续回交4代，回交每个世代采用DB基因功能性标记进行选择，确保DB基因不丢失，同时遗传背景回复到中棉所100，在BC5代所选单株进行自交，获得DB基因纯合的BC5F2单株，培育成含DB基因的有限果枝陆地棉新品系DB-中100，其纤维品质等农艺性状与中棉所43没有差异，但开花期，成熟期提早7～10d有限果枝类型。
扩增结果见图3。由图3可知，BC1F1代经SDS-PAGE凝胶电泳得到含DB基因。
可以看出，培养的含有DB基因的新品系DB-中100植株开花期，成熟期提早，果枝类型为有限。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 一种控制棉花有限果枝性状的DB基因及其编码蛋白和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1013
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 1
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtgttg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtaactata catgtcgcta atactctctt ttcttttctt 240
tttttctgga tttttcaaga gaaaatgtct atcagcaatc atatttttat attgcaggtg 300
atgacagacc cagatgttcc tggtcctagt gacccttacc tgagggagca cttacactgg 360
tacttctctt aatcaaacta catgtataaa aatacaaaat atattaacca ttaatactaa 420
tatataactt ccatagggaa gctgacaatg atctatctat ctatctatat atatataatg 480
actgttaggg ctcataattt ccttggcttg ataaagctaa aaaaaaagga aataagattt 540
catcaaaaca agaagagcac aaatttaagc aatctactga atatttgtac ttgaattgac 600
aatctcacag gatagtgaca gatatccccg gcacaacaga tgccacattt ggtaagtatc 660
ctcttcattc ttcatagaga gagagagaga gagagagaga gagagacaga gagagagaga 720
gagcattata tgatagaaaa tggactaact ttgatggtta aaaatataat tataaaatat 780
atatacacac aggaagggaa atggtgaact acgaaatgcc aaggtcaaac atagggatcc 840
acaggtttgt gttcctcctc ttcaagcaaa aaggcaggca aacagtgaga agcataccgt 900
catcaaggga tcgtttcgat accaggaagt ttgcagaaga aaacgaacta ggggttcctg 960
ttgcagctgt ctatttcaat gctcaaaggg aaacagctgc tagaagacgc taa 1013
<210> 2
<211> 525
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 2
atggcaaaac tgtcagatcc tcttgtgttg gggagagtga ttggggatgt tattgatgcc 60
ctctccccat ctgtgaaaat gtcagtcact ttcaacacca acaagcaggt atataatggc 120
catgaatttt ttccatctgc agttactaac aagcctaagg ttgaggttca tggaggtgat 180
atgagatcct ttttcaccct ggtgatgaca gacccagatg ttcctggtcc tagtgaccct 240
tacctgaggg agcacttaca ctggatagtg acagatatcc ccggcacaac agatgccaca 300
tttggtaagg aaatggtgaa ctacgaaatg ccaaggtcaa acatagggat ccacaggttt 360
gtgttcctcc tcttcaagca aaaaggcagg caaacagtga gaagcatacc gtcatcaagg 420
gatcgtttcg ataccaggaa gtttgcagaa gaaaacgaac taggggttcc tgttgcagct 480
gtctatttca atgctcaaag ggaaacagct gctagaagac gctaa 525
<210> 3
<211> 174
<212> PRT
<213> Gossypium hirsutum Linn
<400> 3
Met Ala Lys Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Gly Arg Val Ile Gly Asp
1 5 10 15
Val Ile Asp Ala Leu Ser Pro Ser Val Lys Met Ser Val Thr Phe Asn
20 25 30
Thr Asn Lys Gln Val Tyr Asn Gly His Glu Phe Phe Pro Ser Ala Val
35 40 45
Thr Asn Lys Pro Lys Val Glu Val His Gly Gly Asp Met Arg Ser Phe
50 55 60
Phe Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp Val Pro Gly Pro Ser Asp Pro
65 70 75 80
Tyr Leu Arg Glu His Leu His Trp Ile Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr
85 90 95
Thr Asp Ala Thr Phe Gly Lys Glu Met Val Asn Tyr Glu Met Pro Arg
100 105 110
Pro Asn Ile Gly Ile His Arg Phe Val Phe Leu Leu Phe Lys Gln Lys
115 120 125
Gly Arg Gln Thr Val Arg Ser Ile Pro Ser Ser Arg Asp Arg Phe Asp
130 135 140
Thr Arg Lys Phe Ala Glu Glu Asn Glu Leu Gly Val Pro Val Ala Ala
145 150 155 160
Val Tyr Phe Asn Ala Gln Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg Arg
165 170
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggcaaaac tgtcagatcc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttagcgtctt ctagcagctg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagatgccac atttggtaag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtggatcc ctatgttaga 20
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