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Isolation and efficient strain screening of microorganisms from peanut rhizosphere

花匠小妙招
2024-11-10 22:19

摘要: 【背景】花生根际分布着丰富的微生物类群，分离筛选多种功能的高效微生物是研发高效复合菌肥的基础。【目的】从花生根际土壤及根表分离微生物，分析可培养微生物的多样性，筛选高效解有机磷和无机磷、产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)和铁载体功能的菌株，为研发花生微生物菌肥打下基础。【方法】利用稀释涂布法，从采自山东省栖霞市、平度市、烟台市莱山区3个样点的花生根际土、根表样品中分离微生物，基于16S rRNA基因序列对其进行系统发育分析，并通过初筛和复筛筛选高效解磷、产IAA和铁载体的菌株。【结果】共分离、纯化、保藏147株菌，其中75株分离自根际土壤，72株分离自根表样品。系统发育分析表明所有的菌分布于放线菌门(Actinomycetota)、芽孢杆菌门(Bacillota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和假单胞菌门(Pseudomonadota)这4个门的40个属，优势属为链霉菌属(Streptomyces, 21.77%)、芽孢杆菌属(Bacillus, 16.33%)；根表样品微生物的多样性高于根际样品；共筛选到解有机磷菌株62株，短波单胞菌(Brevundimonas) YTU21021解有机磷能力最强为1.12 mg/L；解无机磷菌株31株，不动杆菌(Acinetobacter) YTU21009解无机磷能力最强为7.04 mg/L；产IAA的菌株63株，肠杆菌(Enterobacter) YTU21054产IAA量最高，达184.19 mg/L；产铁载体细菌7株，伯克氏菌(Burkholderia) YTU21051产铁载体能力最强，As/Ar为0.90。【结论】花生根际和根表样品中可培养微生物多样性较为丰富，本研究筛选到的高效功能菌丰富了花生根际功能微生物资源，为后续与高效根瘤菌联合研发花生复合微生物菌肥奠定了基础。

Abstract: [Background] The rhizosphere soil harbors diverse microorganisms. The isolation and screening of efficient strains with different functions is the premise for the development of efficient composite microbial fertilizers. [Objective] To isolate microorganisms from the rhizosphere soil and root surface of peanut and screen out efficient strains with organic and inorganic phosphorus-solubilizing, indole-3-acetic acid (IAA)-producing, and siderophore-producing functions, so as to lay a foundation for the research and development of microbial fertilizers for peanut. [Methods] The dilution-plate coating method was employed to isolate the microorganisms from the peanut rhizosphere soil and root surface samples collected from Qixia City, Pingdu City, and Laishan district of Yantai City in Shandong Province. The microorganisms were identified by the phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequences. The strains with efficient organic and inorganic phosphorus-solubilizing, IAA-producing, and siderophore-producing functions were obtained through primary and secondary screening. [Results] A total of 147 strains were isolated, purified, and preserved in this study, including 75 strains isolated from the rhizosphere soil samples and 72 strains from the root surface samples. The isolates belonged to 40 genera of 4 phyla including Actinomycetota, Bacillota, Bacteroidota, and Pseudomonadota. Streptomyces (21.77%) and Bacillus (16.33%) were the dominant genera. The root surface samples had higher alpha diversity of microbial community than the rhizosphere samples. Among the 62 strains with organic phosphorus-solubilizing ability, Brevundimonas sp. YTU21021 showed the highest activity of 1.12 mg/L. Among the 31 strains with inorganic phosphorus-solubilizing ability, Acinetobacter sp. YTU21009 showed the highest activity of 7.04 mg/L. Among the 63 strains that could produce IAA, Enterobacter sp. YTU21054 showed the highest yield of 184.19 mg/L. Among the 7 strains capable of producing siderophores, Burkholderia sp. YTU21051 presented the highest efficiency with the As/Ar ratio of 0.9. [Conclusion] There are diverse culturable microorganisms in the rhizosphere and root surface samples of peanut. The efficient functional strains obtained in this study enrich the functional microbial resources in peanut rhizosphere and lay a foundation for the development of composite microbial fertilizers with efficient rhizobia for peanut.

Keywords: peanut rhizospheric microorganisms isolation function screening of efficient microorganisms

花生(Arachis hypogaea L.)又名落花生、长生果等，是起源于南美洲的一年生草本豆科植物，是国际上三大传统油料作物之一，是人类最重要的油脂来源之一[1]。中国是世界上花生主产国之一，中国花生种植面积居世界第二，总产量居世界第一[2]，为我国国民经济贡献巨大。施肥是提高花生产量、改善花生品质的有效措施[3]。但过度施用化肥不仅增加了种植成本，而且会导致土壤酸化，加上由于水土流失导致的河流富营养化，最终造成资源浪费和环境污染，不利于农业可持续发展。发展新型肥料，尤其是以功能微生物为主的生物肥料逐渐成为研究应用的热点。

微生物在土壤中分布广泛、生物量大，可达土壤1011个细胞/g-土壤[4]。根际是靠近根部的区域，植物通过根分泌了5%−21%的光合产物[5]，不同植物的分泌物招募了不同的根际微生物，调控着微生物的群落结构，因此根际被认为是微生物活动的热区(hotspot)，是植物与微生物紧密互作发生的位点，而不同功能微生物也调节着植物生长发育、抗逆、抗病和营养吸收转化等[6-7]。这些根际微生物已成为研发生物肥料的最重要来源。近年来，高通量测序技术的发展和大规模的微生物分离鉴定极大地促进了对根际微生物组的认识及与植物互作的理解[8]。接种促生菌能显著提高作物产量[9]，而接种几种不同功能的菌株合成的简化群落比接种单株促生菌的效果更为稳定[10]。开发多种功能根际微生物合成简化群落已成为农业微生物研究和应用的热点。

作为典型的豆科作物，花生能与根瘤菌结瘤进行共生固氮[11]，其固定的氮是花生的重要氮素来源，能满足花生氮素需求的一半以上[12]。与其他作物一样，花生根际也分布着多样的微生物，部分菌株具有解磷、解钾等功能[13]，相关根际高效菌株的单接种应用能够显著促进花生生长[14]。然而分离、筛选多种功能的高效微生物，研制含根瘤菌和多种功能微生物的复合菌剂，将在有力地提升土壤地力、降低花生生产成本、促进花生产业发展等方面发挥更大功能。

山东省花生种植面积和产量均居全国第2位，总产量约576.7万t[2]，对山东省农业经济贡献很大。本研究从山东省栖霞市、平度市和烟台市莱山区3个采样地采集、分离了花生根际土壤和根表样品中的微生物，基于16S rRNA基因序列研究了可培养微生物的多样性，并筛选了高效解有机磷和无机磷、产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)和铁载体的菌株，以期为花生复合微生物菌肥的研制和应用奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料

1.1.1 样品

2021年7月下旬从山东省栖霞市、平度市和烟台市莱山区采集了花生植株和根际土壤。采样方式：将花生植株连根拔起，将花生植株和根部土壤装入无菌自封袋中，立即带回实验室进行微生物分离。

1.1.2 培养基

培养基及配方如表 1所示，除特殊说明外，配制时均用去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0，固体培养基中琼脂粉添加量为15 g/L，121 ℃灭菌30 min。

表 1　本研究培养基信息Table 1　The information of media used in this study

培养基名称
Medium 用途
Function 参考文献
References NA培养基Nutrient agar medium 微生物分离及培养Bacteria isolation and cultivation [15] TSA培养基Trypticase soy agar medium 微生物分离及培养Bacteria isolation and cultivation [16] 牛肉膏蛋白胨培养基Beef extract peptone medium 微生物培养Bacteria cultivation [13] 解有机磷筛选培养基
Organo-phosphate solubilizing screen medium 解有机磷菌筛选
Organo-phosphate solubilizing bacteria screen [17] 磷酸盐生长培养基National botanical research institute’s phosphate (NBRIP) medium 解无机磷菌复筛
Inorganic phosphate solubilizing bacteria secondary screen [18] 无机磷筛选(PVK)培养基Pikovskaya medium 解无机磷菌筛选
Inorganic phosphate solubilizing bacteria screen [19] LB培养基Luria-Bertani medium 微生物培养Bacteria cultivation [17] MSA培养基Sugar-aspartic acid medium 微生物培养Bacteria cultivation [20] King’ B培养基King’ B medium 产IAA能力筛选IAA producing bacteria screen [21] CAS培养基Chrome azurol sulfonate medium 产铁载体菌筛选
Siderophore producing bacteria screen [20]

1.1.3 主要试剂和仪器

蛋白胨、牛肉粉、琼脂粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、D-甘露醇、三水合磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、葡萄糖、硫酸铵、氯化钾、七水合硫酸亚铁、一水合硫酸锰、碳酸钙、氯化镁、磷酸三钙、蔗糖、天冬酰胺和甘油，国药集团化学试剂有限公司；植酸钙、色氨酸、铬天青S和卵磷脂，上海麦克林生化科技股份有限公司；2, 4-二硝基苯酚指示液，上海易恩化学技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。

超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海美析仪器有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；PCR仪，Bio-Rad公司；超微量分光光度计，Implen GmbH公司。

1.2 花生根际及根表微生物的分离及系统发育分析

1.2.1 微生物的分离纯化

根际微生物的分离：将花生根际土壤从根部分离，分别称取每个样地的5 g花生根际土壤，加入50 mL无菌0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)，30 ℃、140 r/min摇床振荡30 min，静置15 min[22]，取上清液，用PBS缓冲溶液按10倍倍比稀释法稀释成10−1−10−9浓度梯度的菌悬液。

根表微生物的分离：将根系置无菌水中冲洗1次，置于盛有无菌PBS缓冲溶液的烧杯中，超声(720 W，工作1 min，停歇30 s，共30 min)，然后通过8 000 r/min离心5 min获得根系土壤样品[23]。分别称取1 g上述3个地区的花生根表土壤，加入10 mL 0.01 mol/L PBS缓冲溶液，按上述方法稀释成10−1−10−9浓度梯度的菌悬液。分别取0.1 mL各浓度梯度样品涂布于NA和TSA培养基表面，30 ℃倒置培养5−7 d，待长出单菌落后挑取单菌落进行划线培养，反复划线培养直至纯化[17]。将纯菌株置于20% (体积分数)甘油中，于−80 ℃保藏备用。

1.2.2 菌株的系统发育分析

1) 细菌基因组DNA提取和16S rRNA基因扩增

分别刮取少量菌体，利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取所有分离菌株的基因组DNA，并利用超微量分光光度计检测DNA浓度及纯度。利用细菌16S rRNA基因通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)[17]进行扩增。分别取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，取目的条带单一、亮度好的样品送往青岛睿博兴科生物技术有限公司测序。

2) 系统发育树的构建

将测序所得序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，下载序列相似性最大的序列为参考序列。利用MEGA 7.0软件[24]中的Muscle程序对本研究测得序列和参考序列进行比对，进而利用neighbor-joining方法[25]构建系统发育树，自举值设置为1 000。

1.3 分离菌株的功能分析

1.3.1 解有机磷菌的筛选

1) 解有机磷菌的初筛

将菌株分别用灭菌牙签点接至有机磷固体培养基表面，置28 ℃恒温箱中倒置培养4 d[18]，观察溶磷圈产生情况，并采用十字交叉法分别测量溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)[26]。根据D/d比值初步确定其解有机磷的能力。

2) 解有机磷菌的解磷能力分析

将待测菌株接种于LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养，按照参考文献[18, 27]的方法培养菌液OD600至0.6，10 000 r/min离心3 min弃上清，用0.85%的NaCl溶液清洗菌体3次后悬浮于15 mL 0.85%的NaCl溶液中，取1 mL菌液至NBRIP液体培养基中，每个菌株重复3次，30 ℃、180 r/min培养12 h。取5 mL菌液12 000 r/min离心2 min弃沉淀，吸取1 mL上清液利用钼锑抗比色法[28]测定培养液中的溶磷量。根据分光光度法测量不同浓度磷标准溶液的OD700值制成磷标准曲线[28]。

1.3.2 解无机磷细菌的筛选

1) 解无机磷细菌的初筛

分别测定所有菌株在PVK培养基上形成的溶磷圈/菌落直径大小，基于比值进行初筛定性分析，分析方法同上述解有机磷细菌初筛方法。

2) 解无机磷细菌解磷能力分析

将待测菌株接种于50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30 ℃、180 r/min培养12 h得到种子液，菌量约为1×108 CFU/mL。按1%的接种量接种到PVK液体培养基中，30℃、180 r/min培养7 d[29]。以不接菌组为对照，每株菌设置3组平行。结束培养后，分别取发酵液10 mL，8 000 r/min离心15 min，取上清液用钼锑抗比色法测定培养液中溶磷量。

1.3.3 产IAA菌的筛选

1) 产IAA菌的初筛

采用Salkowski比色法[30]进行产IAA细菌的初筛。将待测菌株接种于King’B液体培养基中，30 ℃、180 r/min培养1 d，取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加入等体积的Salkowski比色液(50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3)，以加入50 μL未接菌的King’B液体培养基为对照。将白色陶瓷板于室温避光处放置30 min后进行观察，颜色变粉红者为阳性，颜色越深表示IAA浓度越高。

2) 产IAA菌的复筛

将待测菌株按上述方法培养，培养1 d后取菌悬液10 000 r/min离心10 min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30 min，测定其OD530值。对照标准曲线计算单位体积发酵液中IAA的含量。IAA标准曲线绘制按照刘晔等[31]的方法。

1.3.4 产铁载体菌的筛选

1) 产铁载体细菌的初筛

采用CAS琼脂平板法[20]进行初筛，将待测菌株点接至CAS固体平板上，30 ℃倒置培养4 d[32]。菌落周边产生橘黄色的晕圈为阳性菌株，通过计算晕圈与菌落比值(D/d)[33]初步判断菌株产铁载体能力。

2) 产铁载体细菌的复筛

将待测菌株接种至MSA液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养48 h。取5 mL菌液12 000 r/min离心5 min，取2 mL上清液，加入2 mL CAS检测液[11]，充分混匀静置1 h后测定OD630值(As)[32]，另取未接菌的MSA液体培养基与等体积CAS检测液混匀测定其OD630值(Ar)。用As/Ar表示样品中铁载体的相对含量，数值越低，表示铁载体的含量越大。

1.4 数据处理

使用SPSS20.0软件对试验数据进行统计分析，采用方差分析(ANOVA)和Tukey检验进行方差分析和多重比较(α=0.05)，图表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析2.1 土壤细菌的分离及鉴定结果

从3个地区采集的根际土壤和根表样品中共分离、保藏147株菌。其中，从栖霞样品中分离得到76株菌(45株菌分离自花生根际土壤，31株菌分离自根表样品)；从平度样品中分离得到41株菌(25株菌分离自花生根际土壤，16株菌分离自根表样品)；从烟台市莱山区样品中分离得到30株菌(5株菌分离自花生根际土壤，25株菌分离自根表样品)。

将测得的16S rRNA基因序列，利用DnaSP软件以100%一致度划分单体型，共得到87个单体型，从每个单体型中随机选取一株菌为代表菌株，共选取87个代表菌株。代表菌株的系统发育关系分析(图 1)结果表明，这些菌株分别隶属于放线菌门(Actinomycetota)、芽孢杆菌门(Bacillota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和假单胞菌门(Pseudomonadota)这4个门的40个属，优势属为链霉菌属(Streptomyces，32株，占比21.77%)和芽孢杆菌属(Bacillus，24株，占比16.33%) (图 2)。花生根际及根表细菌群落α多样性指数如表 2所示，根表微生物的Shannon-Wiener指数、Simpson指数和Pielou均匀度指数均高于根际土壤样品，这表明根表菌群的多样性高于根际土壤菌群，而分离自烟台市莱山区的α多样性指数均高于平度和栖霞样点。所有测序菌株的16S rRNA基因序列已提交至GenBank，获得序列登录号为OP623513、OP630732‒OP630816和OP744019。

图 1　基于16S rRNA基因序列构建的花生根际及根表细菌的系统发育树Figure 1　Phylogenetic tree of peanut soil bacteria constructed based on 16S rRNA gene sequences.Tree scale表示1%的核酸差异；分支上的圆点表示为重复1 000次的自展值(bootstrap)，范围在0.5−1.0之间，自展值越大对应的圆点越大；括号内数字是菌株的GenBank登录号Tree scale 0.01 indicating 1% nucleotide sequence divergence; The dots at the nodes of "tree" are represented as bootstrap values that repeat 1 000 times, ranging from 0.5−1.0, the larger the bootstrap value is, the larger the dots will be; The value in brackets is the accession number of the strain in GenBank.

图 2　不同采样点分离的微生物在门和属水平上的分布Figure 2　The classification for microorganisms isolated from different sampling sites at phylum and genus levels.括号内数字为菌株的数量，下同The values in brackets represent the strain numbers, the same below.

表 2　不同样点分离菌株α多样性指数表Table 2　Alpha diversity indexes of microorganisms isolated from different sites

样点/分组
Sample/Group 香农-威纳指数
Shannon-Wiener index 辛普森指数
Simpson index Pielou均匀度
Pielou index 栖霞Qixia 2.66 0.89 0.84 平度Pingdu 2.31 0.83 0.82 莱山Laishan 2.65 0.92 0.96 根际Rhizosphere 2.70 0.89 0.82 根表Rhizoplane 2.97 0.92 0.88

2.2 解有机磷菌的筛选结果

在初筛中共有58株菌(占比39.46%)具有解有机磷活性，这些菌分布于20个属(图 3)。如表 3所示，菌株D/d值在1.09−5.41之间，有6株菌的解有机磷能力较强(D/d > 3.0)，首先是不动杆菌(Acinetobacter) YTU21009，其D/d值为5.41；其次是泛菌(Pantoea) YTU21008和YTU21010，分别为4.30和3.54；再次为伯克氏菌(Burkholderia) YTU21051和YTU21086，分别为3.39和3.01，以及罗尔斯通菌(Ralstonia) YTU21085，为3.13。

图 3　功能菌株的分类地位统计Figure 3　Classification for functional strains isolated in this study.

表 3　解有机磷菌的解磷能力测定Table 3　Determination of phosphate solubilizing ability of organo-phosphate solubilizing bacteria

菌株
Strain No. D/d 溶磷量
P-solubilizing capability (mg/L) YTU21002 1.79 − YTU21008 4.30 1.03±0.26a YTU21009 5.41 0.08±0.03de YTU21010 3.54 − YTU21012 2.09 − YTU21018 1.27 − YTU21021 2.01 1.12±0.05a YTU21023 1.45 − YTU21044 1.97 − YTU21045 2.21 0.3±0.03c YTU21046 1.13 − YTU21048 1.41 − YTU21050 2.05 0.07±0.02e YTU21051 3.39 0.18±0.04cde YTU21054 1.39 − YTU21062 2.00 − YTU21074 1.66 − YTU21076 1.29 − YTU21080 1.20 − YTU21085 3.13 0.79±0.04b YTU21086 3.01 − YTU21103 1.20 − YTU21104 1.13 − YTU21110 1.40 − YTU21117 1.66 − YTU21125 1.59 − YTU21126 2.29 0.11±0.04de YTU21127 1.09 − YTU21144 1.46 − YTU21145 1.25 − 同列不同字母表示差异显著(P < 0.05). −：未测其溶磷量. 下同
Different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. −: Not determined. The same below.

对D/d值> 2.0的解有机磷代表菌株进行解有机磷能力复筛测定，结果表明8株菌具有较强的解有机磷能力(表 3)，溶磷能力最强的是短波单胞菌(Brevundimonas) YTU21021，为1.12 mg/L。

2.3 解无机磷菌的筛选结果

初筛中共有31株菌(占比19.72%)具有解无机磷能力，这些菌分布于14个属(图 3)。菌株D/d值在1.07−2.00之间(表 4)，有12株菌的D/d值在1.5−2.0之间，这些菌解无机磷能力较强，其中泛菌(Pantoea) YTU21008的D/d值最大，为2.00。其余菌株的D/d值在1.0−1.5之间，这些菌解无机磷能力较弱，红球菌(Rhodococcus) YTU21110的D/d最小，为1.07。对D/d值> 1.10的解无机磷代表菌株进行复筛测定，其中9株菌有较强的解无机磷能力(表 4)，溶磷量最大的是不动杆菌(Acinetobacter) YTU21009，为7.04 mg/L。

表 4　解无机磷细菌的解磷能力测定Table 4　Determination of phosphate solubilizing ability of inorganic solubilizing bacteria

菌株
Strain No. D/d 溶磷量
P-solubilizing capability (mg/L) YTU21002 1.19 5.24±0.23b YTU21008 2.00 0.68±0.09e YTU21009 1.50 7.04±0.66a YTU21010 1.87 − YTU21014 1.53 − YTU21018 1.55 1.43±0.45d YTU21021 1.24 − YTU21023 1.19 2.11±0.20c YTU21032 1.55 − YTU21045 1.30 − YTU21048 1.29 − YTU21050 1.27 − YTU21051 1.55 0.08±0.03f YTU21054 1.20 − YTU21058 1.80 1.72±0.29cd YTU21060 1.51 − YTU21080 1.22 2.17±0.09c YTU21085 1.35 − YTU21086 1.53 − YTU21110 1.07 − YTU21125 1.65 0.06±0.02f YTU21126 1.28 − YTU21128 1.57 −

2.4 产IAA菌的筛选结果

在初筛中，共有分布于27个属的63株菌具有产IAA的能力(图 3)。其中有29株菌与Salkowski比色液反应后呈现粉红色较深(++)。根据分光光度法，对初筛产量较高的29株菌进行产IAA量测定，结果如表 5所示，19株菌的IAA产量较高，在1.97‒184.19 mg/L之间，其中产量高的是菌株肠杆菌(Enterobacter) YTU21054，其产量为184.19 mg/L。

表 5　产IAA菌株的能力测定Table 5　Determination of IAA producing bacteria

菌株
Strain No. 颜色深浅
The color depth IAA产量
IAA yield (mg/L) YTU21002 + − YTU21003 ++ 11.19±1.84lmn YTU21007 ++ 35.66±4.66ef YTU21008 ++ 18.42±0.13jk YTU21016 ++ 24.36±0.53hj YTU21018 ++ 14.70±0.66klm YTU21021 ++ 31.32±1.98fg YTU21023 ++ 40.87±5.53de YTU21037 + − YTU21039 ++ 9.21±0.66mn YTU21046 ++ 83.46±2.59c YTU21048 + − YTU21050 + − YTU21051 + − YTU21054 ++ 184.19±4.31a YTU21064 + − YTU21065 + − YTU21066 + − YTU21068 + − YTU21069 + − YTU21071 + − YTU21076 + − YTU21077 + − YTU21078 + − YTU21079 ++ 16.91±0.38kl YTU21080 ++ 80.19±1.24c YTU21082 ++ 11.38±2.48lmn YTU21085 ++ 27.16±0.24gh YTU21092 + − YTU21093 + − YTU21094 + − YTU21099 + − YTU21100 + − YTU21102 ++ 36.93±5.85def YTU21104 ++ 7.33±2.05no YTU21113 ++ 107.47±1.81b YTU21117 ++ 41.69±2.76d YTU21119 + − YTU21123 + − YTU21125 + − YTU21126 + − YTU21146 + − YTU21147 ++ 1.97±0.69o +：粉红颜色浅；++：粉红颜色深. −：未测其IAA产量
+: Pink color light; ++: Pink color dark. −: The IAA yield is not measured.

2.5 产铁载体菌株的筛选结果

在初筛中共有7株菌具有产铁载体的能力，分布于4个属：芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、根瘤菌属(Rhizobium)和链霉菌属(Streptomyces) (图 3)。它们的D/d值在1.37−4.32之间，其中链霉菌(Streptomyces) YTU21035的D/d值最大，为4.32 (表 6)。对这7株菌的产铁载体能力复筛，结果如表 6所示，菌株伯克氏菌(Burkholderia) YTU21051的As/Ar值最小，为0.90，表明该菌产铁载体的能力最强。

表 6　产铁载体细菌的能力测定Table 6　Determination of siderophore producing bacteria

Strain No. D/d As/Ar YTU21013 1.65±0.07d 4.16±0.07a YTU21035 4.32±0.06a 1.78±0.04c YTU21051 1.37±0.08e 0.90±0.08d YTU21064 1.94±0.09c 1.74±0.22c YTU21065 1.64±0.05d 1.62±0.05c YTU21069 3.37±0.04b 2.64±0.30b YTU21119 1.7±0.02d 1.71±0.28c

3 讨论3.1 花生根际微生物多样性

本研究从山东省平度市、栖霞市和烟台市莱山区3个样地采集了花生根系样品，从每个样地花生根际、根表样品分离、保藏了147株菌，对所有菌株的16S rRNA基因进行扩增分析，并基于系统发育关系将这些菌分类为4个门6个纲40个属，其中优势属(> 10%)是链霉菌属(Streptomyces)和芽孢杆菌属(Bacillus)，分别占比为27.59%和10.34% (图 2)。

3.2 解磷、产吲哚乙酸和产铁载体高效菌株筛选

通过初筛确定了解有机磷、无机磷、产吲哚乙酸和产铁载体的功能菌株，共有97株菌(占比65.99%，分布于31个属)有至少1种测定的功能(图 3)，因此，花生根际存在着丰富的功能性微生物，分别选择功能性较强的菌株进行了复筛测定，确定高效菌株。

磷是植物生长所需的三大营养元素之一，土壤中的磷大多以难溶性磷酸盐的形式存在，难以被作物直接吸收利用[34]。解磷菌一方面可以分泌质子和有机酸，降低土壤介质的碱度或通过羟基和羧基与铁、铝、镁和钙等金属阳离子螯合，使难溶性无机磷酸盐中的磷得以释放出来；另一方面也可以通过分泌磷酸酶来矿化有机磷[35]，使得无机和有机难溶性磷酸盐中的磷元素释放，增加土壤有效磷的含量，有利于植物吸收利用[36]。本研究初筛共筛选到分布于20个属的58株解有机磷菌株和分布于14个属的31株解无机磷菌。解有机磷的菌数量、属的分布均多于解无机磷菌株，这与桉树等根际解磷菌[34]的报道一致。说明植物根际解有机磷功能的菌比解无机磷的菌分布更广泛。本研究筛选到的解无机磷、有机磷高效菌株的联合应用将更有效地利用土壤中的多种难溶性无机、有机磷。

吲哚乙酸(IAA)是一种植物激素，具有促进植物细胞生长、促进细胞分裂和分化、促进根系生长等功能[37]。已报道的多种微生物，如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌(Enterobacter)、微杆菌属(Microbacterium)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮菌属(Azotobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)等属的菌具有产IAA的能力[38-39]，如张东艳等[30]从花生根际中筛选到5株高产IAA菌株，其中特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis) HS10的产量高，达52.03 mg/L。张昊鑫等[39]从烟草根际土壤中际筛选出一株产IAA能力的魏德曼尼芽孢杆菌(Bacillus wiedmannii)，产量达61.71 mg/L。本研究共筛选到分布于27个属的63株产IAA菌株，其中链霉菌属(Streptomyces)和芽孢杆菌属(Bacillus)分别有15株和9株，为产IAA的优势属。肠杆菌(Enterobacter) YTU21054的产量最高达184.19 mg/L，其产量远高于国内外同行报道的高效菌株产量[30, 39-40]，具有较强的应用潜力。

铁是地壳中第四丰富的元素，其虽在地壳中含量较高，但由于地球的富氧环境，铁元素通常以氧化物如Fe(OH)3等以溶解度极低的形式存在，不易被植物吸收利用[41-42]。土壤微生物产生的铁载体可以特异螯合Fe3+，即使在铁离子很低的浓度下也能将其吸收[32]，铁载体还能提高植物的抗病能力[41, 43]。目前已发现芽孢杆菌属(Bacillus)、普里斯特氏菌(Priestia)、肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)等多个属的作物根际促生菌能产生铁载体，并有很强的促生和提升作物抗铁胁迫能力[44]。本研究筛选到分布于4个属的7株产铁载体菌株，其中伯克氏菌(Burkholderia) YTU21051产铁载体的能力较强(As/Ar值为0.90)，有较强的应用潜力。

4 结论

本研究从山东省栖霞市、平度市和烟台市莱山区的花生根际及根表样品中分离得到147株菌，分布于4个门的40个属，丰富了花生根际微生物资源。其中分布于31个属的97株菌(占比65.99%)有至少1种测定的功能，功能菌数量占比较高。共筛选到58株解有机磷能力的菌株，其中短波单胞菌(Brevundimonas) YTU21021的溶磷量最大，为1.12 mg/L；解无机磷能力的菌株31株，其中不动杆菌(Acinetobacter) YTU21009溶磷量最大，为7.04 mg/L；产IAA菌株63株，其中肠杆菌(Enterobacter) YTU21054的IAA产量最高，为184.19μg/mL；产铁载体菌株7株，其中产铁载体能力最强的是伯克氏菌(Burkholderia) YTU21051，As/Ar值为0.90。本研究筛选到的高效解有机磷、无机磷、产IAA和产铁载体的功能菌，为后续与高效根瘤菌联合研发复合微生物菌肥奠定了基础。

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