菌根真菌对白及种子萌发和幼苗生根的作用
Effects of mycorrhizal fungi on seed germination and seedling rooting of Bletilla striata
XU Ling-Ling ,1,*, ZHANG Yan1, ZHAO Ming-Yang1,2, LI Xiao-Xiao1, NAN Meng-Yue1, MENG Fan-Ju1
1.
2.
白及Bletilla striata (Thunb.) Rchb. f.是典型的地生型兰科植物Orchidaceae,在我国广泛分布（杨平厚和孙承骞 1998）。除药用外（Liu et al. 2012;国家药典委员会 2015）,在工业上用途也非常广泛（Zhang et al. 2015）。Masuhara & Katsuya（1989）从白及根中分离菌根真菌,大部分菌株为Rhizoctonia repens Bernard（teleomorph Tulasnella）。从斑叶兰Goodyera schlechtendaliana Rchb. f.、绶草Spiranthes sinensis (Pers.) Ames、金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.、Ponerorchis kurokamiana (Hatus. & Ohwi) J.M.H. Shaw和雨蝶兰P. graminifolia Rchb. f.分离的菌根真菌菌株也能够促使白及种子萌发,但对原球茎的发育没有效果。Yamamoto et al.（2017）采用一株分离自Pecteilis radiata (Thunb.) Rafin.的Rhizoctonia repens菌株HR1-1使白及种子成功分化至原球茎阶段。其他兰科植物分离出的菌根真菌也能促使白及种子萌发,甚至发育成原球茎,说明白及萌发至形成原球茎阶段对菌根真菌的专一性并不强。
虽然目前可以对白及种子进行处理后直接播种繁殖（牛俊峰和王喆之 2016;汪梦婷等 2018）,但种质不稳定、生长周期长等问题一直制约产业发展。组织培养技术能够保持白及种质的稳定性并实现快速繁殖（吕鼎豪 2014）,但也存在有效药用成分低,且对生产条件和技术人员要求高等问题。因此,筛选、研究和利用具有促进白及种子萌发和幼苗建成作用的菌根真菌,对白及产业健康稳定和可持续发展非常重要。
本研究通过预实验筛选出4株能够与白及种子共生形成菌丝团的菌根真菌,通过ITS序列比对进行初步分子鉴定;通过共生萌发实验,评价4个菌根真菌菌株在光照和黑暗条件下促白及种子萌发的效果,并对效果好的菌株进一步评价其促幼苗生根的情况。旨在筛选出对白及种子萌发和根的建成具有显著促进作用的菌株,为进一步快速繁育优质白及种苗和保育工作打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
种子采自陕西省汉中市宁陕县皇冠镇白及大田。4个白及菌根真菌菌株都分离自陕西省大田种植的白及原球茎或成年植株根中（表1）。
表1 白及菌根真菌的分子鉴定
Table 1
Isolate (accession number)GenBank中ITS最相似序列（收录号）
Closest match sequence of ITS in GenBank (accession number)相似度
Percent identity (%)比对长度
Alignment length (bp)来源
Source采集地
SiteWQ17-33 (MK894415)Coprinus patouillardi (FN396151)97.6639原球茎
Protocorms渭南市
Weinan cityWQ17-43
(MK894417)Tulasnella sp. (JX545220)99618原球茎
Protocorms渭南市
Weinan cityJST-13
(MF071205)Serendipita sp. (KY509317)99.7600原球茎
Protocorms安康市
Ankang citySL15-7 (MG992005)Sebacina sp. (MK226175)90.7582根
Roots商洛市
Shangluo city
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1.2 DNA提取及序列分析
将菌根真菌接种至铺有玻璃纸的无菌PDA培养基中培养7d,用无菌解剖刀刮取少量菌丝进行DNA提取,用于PCR扩增。扩增引物为ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。25μL PCR反应体系为1μL模板DNA,ITS5和ITS4引物（10μmol/L）各1μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5μL,ddH2O 9.5μL。PCR反应程序为94℃ 3min;95℃ 40s,56℃ 40s,72℃ 1min,35个循环;72℃ 10min。将PCR产物送上海生工生物工程（上海）股份有限公司测序,并将序列提交NCBI GenBank数据库获得序列号（表1）。将ITS序列在NCBI数据库中进行比对,选取相似性较高的序列用于初步分子鉴定。
1.3 室内共生萌发和幼苗生根
将直径6cm 200目尼龙网布灭菌后平铺于直径9cm燕麦培养基（OMA）表面（Khamchatra et al. 2016）。每个培养皿接种3个直径0.5cm、PDA培养7d的真菌菌饼,培养10d后至菌丝长满整个尼龙网布。白及种荚表面灭菌（0.1% HgCl浸泡15min,无菌水冲洗3-4次）后,用无菌手术刀切开果荚,将种子撒入1g/L琼脂溶液中制成种子悬浮液,再用移液枪吸取150mL种子悬浮液（约140粒种子）均匀播种在长满真菌的尼龙网布上,以不接种真菌菌株的播种白及种子的处理作为对照组。用封口膜将培养皿封好,置于人工气候箱内(25±2)℃培养。对照组和不同菌株处理组都再设置暗培养（L/D 0/24h）和12h光照（L/D 12/12h,光照强度2 500Lx）培养处理以观察光照对种子萌发的影响。共10个处理,每个处理10个重复。种子萌发形成叶片后如果不进行光照,无法进行光合作用,会出现生长停滞的状态（Wang et al. 2011;Sheng et al. 2012）。因此,当种子萌发形成原球茎后所有处理都进行光照,继续培养。培养10d、20d和30d后用体式显微镜（ZSA0745,重庆重光）观察种子萌发情况,用0-5阶段描述种子和幼苗的生长发育情况（吴慧凤等 2012）。每个生长阶段的萌发率=萌发的该阶段的种子数/播种的种子总数×100%。60d后,将促萌发效果好的菌株共生萌发的幼苗转接至铺有OMA培养基的兰花瓶中继续培养60d,测量其幼苗的根长和根数与对照进行比较来评价菌根真菌促生根情况。
1.4 萌发种子中菌丝团染色和观察
参考Yamamoto et al.（2017）的方法,并进行了改进。将萌发20d的种子在4℃的FAA溶液中固定至少24h,用孔径40μm过滤筛网（跃阳筛网,浙江,中国）过滤并用蒸馏水冲洗以去除FAA。将冲洗后的萌发种子放入10%（W/V）KOH溶液121℃高压灭菌20min后用2%（V/V）HCl中和5min,转移至10%（V/V）百利金4001亮黑墨水溶液（10%墨水和3%乙酸）中,95℃加热30min后浸泡在100%乳酸中于4℃保存。使用显微镜（Ni-U,Nikon,Tokyo,Japan）观察菌丝团生成情况,再使用显微成像系统（DS-U3-Fi2,Nikon,Tokyo,Japan）拍摄照片。
1.5 数据分析
SPSS 19软件（Statistical Package for the Social Sciences）在P<0.05水平上对数据进行单因素方差（ANOVA）和邓肯（Duncan）多重范围检验,结果表示为平均值±标准偏差。
2 结果与分析
2.1 菌根真菌分子鉴定
4株菌根真菌WQ17-33、WQ17-43、JST-3和SL15-7分别与鬼伞属Coprinus、胶膜菌属Tulasnella、腊壳菌属Sebacina和Serendipita真菌相似性最高,分别为97.6%、99.0%、99.7%和90.7%（表1）。
2.2 光照对共生萌发的影响
第10天种子主要的萌发阶段是第3阶段,即原球茎发育阶段（图1A,1D,1G,1J）,暗培养较光照培养对菌株SL15-7和JST-13共生萌发形成原球茎有显著的促进作用（图1D,1G）,而对菌株WQ17-33和WQ17-43没有显著影响（图1A,1J）。之后全部进行光照培养,至20d时,大部分的种子都萌发至阶段4,即长出第一片叶子,形成幼苗。此时前10d是否光照对菌株SL15-7和JST-13共生萌发至该阶段的萌发率影响不显著（图1E,1H）,暗培养对菌株WQ17-33较光照效果好（图1B）,光照对菌株WQ17-43较暗培养效果好（图1K）。共生萌发30d时,仍以第4阶段为主,前期光照对菌株WQ17-33该阶段共生萌发效果较黑暗好（图1C）,其他3个菌株前10d是否进行光照无显著差异。
图1
图1 光照对白及种子共生萌发的影响
横坐标stage 0-5分别表示不同发育阶段,即未萌发、种胚膨大、种胚继续扩大种皮破裂、出现原生分生组织（原球茎发育阶段）、长出第一片叶子和长出第二片叶子;同一菌株柱状图不同小写字母表示有显著性差异（P<0.05,Duncan）,无色柱图表示全程光照培养（L/D=12h/12h）,有色柱图表示前10d进行暗培养,之后光照培养（L/D=12h/12h）;A,D,G,J表示共生萌发培养时间为10d;B,E,H,K表示共生萌发培养时间为20d;C,F,I,L表示共生萌发培养时间为30d
Fig. 1 Effects of light on symbiotic germination of Bletilla striata.
Stages 0-5 represent no germination, enlarged embryo, continued embryo enlargement, appearance of protomeristem, emergence of first leaf and emergence of second leaf, respectively. The different lower case letters in every histogram represent significant difference (P<0.05, Duncan HSD). The colorless columns indicate the seeds cultivated with light (L/D=12h/12h), while the colored ones in dark (L/D=0h/24h) for the first 10d and subsequent with light (L/D=12h/12h). The histograms in three rows indicate that the incubation time is 10, 20 and 30d, respectively.
因此,前10d暗培养较光照培养对菌株SL15-7和JST-13共生萌发形成原球茎具有显著的促进作用,但对之后幼苗的形成效果影响不显著;而前10d是否光照培养,对菌株WQ17-33和WQ17-43共生萌发白及种子原球茎的形成没有显著影响,但对之后形成幼苗效果有影响。
2.3 不同菌根真菌菌株对共生萌发的影响
将各菌株在10d、20d和30d主要发育阶段的共生萌发效果进行比较。因为前10d暗培养对部分菌株共生萌发较光照有明显促进作用,因此重点比较前10d暗培养条件下,不同菌株对白及种子共生萌发的促进效果。结果表明共生萌发第10天,菌株JST-13和SL15-7对原球茎发育较对照有明显的促进作用（图2A）;第20天,菌株WQ17-33、JST-13和SL15-7对幼苗发育（4阶段,长出第一片叶子）较对照有明显促进作用（图2B）;第30天,萌发种子还是以阶段4为主（图1）,无菌株较对照有明显的促进作用（图2C）,但菌株SL15-7第5阶段（长出第二片叶子）较其他处理有明显促进效果,说明第30天时菌株SL15-7已经向第5阶段发育。
图2
图2 不同菌根真菌菌株与白及共生萌发效果比较
A：第10天,原球茎阶段萌发率;B：第20天,一片叶幼苗阶段萌发率;C：第30天,一片叶幼苗阶段萌发率;D：第30天两片叶幼苗阶段萌发率,同一柱状图不同小写字母表示有显著差异（P<0.05,Duncan）
Fig. 2 A comparison of effects of different mycorrhizal fungal isolates on symbiotic germination of Bletilla striata.
A: The protocorm stage germination rate on the 10th day; B: The germination rate of seedling stage with one leaf on the 20th day; C: The germination rate of seedling stage with one leaf on the 30th day; D: The germination rate of seedling stage with two leaves on the 30th day. The different lower case letters in every histogram represent significant difference (P<0.05, Duncan).
共生萌发第20天时观察不同菌株处理组萌发种子中菌丝团定殖情况,结果表明菌株SL15-7和JST-13处理组共生萌发形成的叶片较对照、WQ17-33和WQ17-43处理组大（图3A-3E）,且定殖在种子中形成的菌丝团也较菌株WQ17-33和WQ17-43处理组多（图3F-3J）。
图3
图3 白及共生萌发和不同菌株菌丝团形成情况
A-E分别为对照、WQ17-33、WQ17-43、JST-13和SL15-7促白及种子萌发情况,放大倍数均为30倍;F-J分别为以上5个处理萌发的白及种子中菌丝团形成情况,箭头所指为菌丝团,放大倍数均为100倍
Fig. 3 The symbiotic germination of Bletilla striata and peloton formation under the treatments of different fungal isolates.
A-E: Seed germination of CK, and seed germination under the treatments of WQ17-33, WQ17-43, JST-13 and SL15-7, respectively; Magnification of 30 times. F-J: Peloton formation of germinated seeds of Bletilla striata under the treatments of different fungal isolates; the arrows refer to the pelotons; Magnification of 100 times.
2.4 共生萌发幼苗生根情况比较
将共生萌发效果好的处理组菌株JST-13和SL15-7在平板共生培养60d后,又在铺有OMA培养基的兰花瓶中继续培养60d。结果表明,两个菌株能有效促进白及种子萌发形成的幼苗根的建成。其中菌株SL15-7和JST-13共生萌发形成的白及幼苗的根长（图4A）和根数（图4B）在P<0.05的水平较对照都有显著提高,且菌株SL15-7对根长的促进效果最好（图3A,3C-3E）。
图4
图4 白及幼苗的生根情况
A：根长;B：根数;C-E分别表示对照、JST-13和SL15-7处理组幼苗的生根情况,A和B中不同小写字母表示有显著性差异（P<0.05,Duncan）,标尺：C-E=1.5cm
Fig. 4 Rooting of seedlings of Bletilla striata.
A: Root length; B: Root number; C-E: Rooting of seedlings in the CK, and under the treatments of JST-13 and SL15-7, respectively. The different lower case letters in A and B represent significant difference (P<0.05, Duncan). Bars: C-E=1.5cm.
3 讨论
获得兰科植物促种子萌发和幼苗根建成的有效共生真菌,是进行兰科植物保育和合理应用的关键环节。本研究涉及的4株菌根真菌WQ17-33、WQ17-43、JST-3和SL15-7分别与鬼伞属、胶膜菌属、腊壳菌属和Serendipita真菌具有最高的相似性。从虎舌兰Epipogium roseum (D. Don) Lindl.根中分离出的一株鬼伞属真菌能够促使虎舌兰种子萌发,尽管萌发率较低,但对后期植株的生长发育具有较好的促进作用（Yamato et al. 2005;Takahiro et al. 2007）。胶膜菌属、Serendipita和腊壳菌属真菌是兰科植物中常见的菌根真菌类群,其无性型都属于丝核菌属Rhizoctonia,丝核菌属本身是一个复合群（Dearnaley et al. 2012）。杓兰属Cypripedium植物与多种胶膜菌共生（Shefferson et al. 2007）;而腊壳菌属和Serendipita同属于腊壳菌目Sebacinales,有研究表明腊壳菌属主要与没有叶绿素的异养型兰科植物共生,Serendipita多为自养型兰科植物菌根真菌（Michael et al. 2011;Weiss et al. 2016）。而本文报道的腊壳菌属菌株SL15-7却分离自自养地生型兰科植物白及根中（表1）,不仅对白及种子萌发形成原球茎和幼苗有促进作用,对幼苗根的建成也有显著效果（图2-图4）。说明膜壳菌属真菌与兰科植物的共生关系可能比之前的认识要复杂。
尽管促萌发的效果不同,但4个菌株都能与白及形成共生关系,即在萌发种子中形成菌丝团（图3G-3J）。且4个菌株分属于4个属、4个科,说明白及与菌根真菌的专一性较弱,能够广泛地与土壤中的菌根真菌形成共生关系。4个科的不同菌根真菌与同一兰科植物在种子萌发过程中建立明确共生关系（形成菌丝团）的报道尚属首次。但已经证明地生兰与菌根真菌存在复杂的共生关系。例如,杓兰属Cypripedium植物作为非常典型的地生兰,与胶膜菌在科的水平上具有专一性（Shefferson et al. 2005）;而同一生境的不同种杓兰属植物对不同类群的胶膜菌表现出不同的偏好性（preference）（Yuan et al. 2010）;大花杓兰的变种C. macranthos Sw. var. rebunense (Kudô) Miyabe & Kudô和C. macranthos Sw. var. speciosum (Rolfe) Koidz.在幼年以及成年植株两个不同发育阶段,其共生胶膜菌的类群在系统发育关系上属于两个完全不同的分支,说明大花杓兰在幼年向成年发育过程中共生胶膜菌类群会发生改变（Shimura et al. 2009）。本研究中SL15-7分离自成年植株根中,但却对种子萌发和幼苗建成表现出了较强的促进作用（图2-图4）。可能存在从种子萌发、幼苗生长至成年植株整个发育过程都具有促进作用的“万能”菌株,这对白及的保育和利用具有非常重要的意义。因此,白及与菌根真菌的专一性较弱,可与多种类群菌根真菌共生,这也许是白及能够广泛分布,并可以大规模地进行人工种植的原因。
4株共生菌根真菌中,只有SL15-7在整个种子萌发的过程中表现出了显著的促进作用,但其他菌株可能在共生关系中扮演着其他角色。例如共生萌发30d时,JST-13在前期黑暗培养条件下有效促进原球茎和早期幼苗阶段萌发率（图2A,2B）,但30d时,幼苗的萌发率较同等培养条件下的对照组又不显著了,说明其主要作用可能是促进幼苗萌发和早期快速形成幼苗。而另外两株菌WQ7-33和WQ7-43,尽管没有发现明显的促萌发作用,但共生萌发20d形成的原球茎较对照体积大（图3）,其功能有可能是增加萌发形成原球茎的生物量,以协助其他真菌进一步提高成苗率。另外也有文献报道,不同的内生真菌之间可能具有协同作用,例如从大花蕙兰植株根中分离出来的内生菌Umbelopsis nana (Linnem.) Arx和菌根真菌Epulorhiza repens Br. ML01同时接种,促生效果优于两菌株单独接种（Zhao et al. 2014）。因此,尽管都能在种子萌发过程中与种子建立共生关系（形成菌丝团）,但4株菌根真菌的功能可能不同。种子萌发和之后的幼苗建成是一个复杂的过程,很可能是多种菌根真菌协同作用的结果。
本研究筛选出了对促进白及种子萌发和幼苗生根的有效菌根真菌菌株并发现萌发前期进行暗培养更有利于提高其原球茎和幼苗阶段萌发率。因为白及已经具有非常完善的组织培养和栽培方法体系,以及菌根真菌分离培养和生物功能验证方法体系,未来还需要进一步研究以白及为代表的地生兰与多种真菌的共生作用机制。
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由于人为的采挖和原生境的破坏,使得铁皮石斛野生资源已濒临灭绝。因此,保护铁皮石斛野生资源及其生境,加快其野生资源的繁殖显得非常重要。以铁皮石斛种子(TTC染色显示种子生活力为77.65%)为材料,与分离自2种野生兰科植物根部的4株共生真菌 (C20来自铁皮石斛,L12,L24b 和 L28来自美花石斛)在燕麦培养基上进行共生萌发。经过18周的共生培养,4株真菌均不同程度地促进了铁皮石斛种子的萌发,其中菌株L24b (Epulorhiza)和L28 (Epulorhiza)显著提高了种子的萌发率,分别比对照高出26.51%和12.20%,但未形成幼苗,只是处于原生分生组织阶段(阶段3);菌株C20(Epulorhiza)和L12 (Alternaria) 虽没有显著提高种子的萌发率,但对原球茎的发育和幼苗的生长有明显的促进作用;而对照的种子仍然处于膨大转绿期,即萌发阶段(阶段2)。同时发现,TTC染色显示的铁皮石斛种子生活力要高于种子共生萌发的萌发率(除了菌株L24b)。研究结果表明:种子生活力染色检测的活力值只代表种子所具有的潜在的萌发能力,而不能代表实际的萌发率。在异地条件下,铁皮石斛与共生真菌间没有严格的专一性,可以与瘤菌根菌属、链格孢属真菌形成共生关系。菌株C20和L12能促进萌发后的种子进一步分化成幼苗。这两个菌株为铁皮石斛的人工优质栽培和野外种群的建立提供了可能。
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