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一种猕猴桃果皮提取物及其制备方法与在抑制脂肪酸合酶活性中的应用与流程

花匠小妙招
2025-01-02 11:32

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猕猴桃果皮提取物及其制备方法与在抑制脂肪酸合酶活性中的应用。

背景技术：

脂肪酸合酶是生物细胞内合成脂肪过程中最重要的酶。田维熙等对家禽脂肪酸合酶的研究发现，家禽腹腔的脂肪水平和脂肪酸合酶活性有很高的正相关，并提出控制脂肪酸合酶活性是控制动物体脂水平的有效方法的理论(田维熙,1994.动物的体脂水平和脂肪酸合酶活性的调控.生命的化学,14,(1):184；田维熙等,1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合酶活性的关系.生物化学杂志，12(2):234-236；Mei Li et al.,1999.Factors influencing the levels of fatty acid synthase complex activity in fowl.Biochemistry and Molecular Biology International,47(1):63-69)。2000年，霍普金斯大学Loftus等对小鼠脂肪酸合酶的研究结果证明，抑制脂肪酸合酶可造成丙二酸单酰辅酶A的积累，而后者抑制与进食相关的下丘脑神经肽Y的表达，在不影响小鼠活动能力的情况下使食欲下降，体重降低。T.Loftus等指出，脂肪酸合酶可以作为控制体重潜在的治疗靶位(Loftus.T.M.et al.,2000.Science,288(5475):2379-2381)。此外，许多研究发现脂肪酸合成酶(FAS)的活性和表达在几乎所有的非病态成人组织中表现出极低的水平，而在许多类型的癌组织如直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等中其活性显著提高，表达显著上调。同时，还有研究发现FAS的抑制剂cerulenin能够杀死癌细胞和阻碍异种移植瘤的生长，其他FAS抑制剂如cerulenin的衍生物C75、β-内酯orlistat、EGCG及其他天然来源的黄酮类化合物等和抗生素triclosan也已被确认可以通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞的生长。以上结果表明，脂肪酸合酶可能是潜在的治疗肥胖症和肿瘤的双重靶点。因此，研制和开发脂肪酸合酶的抑制剂将具有重大的现实意义及开发潜力。

猕猴桃(Actinidia chinensis Planch)为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl)的一种落叶木质藤本植物，果可食用，风味独特。猕猴桃除含有猕猴桃碱、蛋白水解酶、单宁果胶和糖类等有机物，以及钙、钾、硒、锌、锗等微量元素和人体所需17种氨基酸外，还含有丰富的维生素C、葡萄酸、果糖、柠檬酸、苹果酸、脂肪，是新兴的健康食品，具有很高的营养价值。中国专利公开号CN105230896A发明了一种以猕猴桃果汁为组分的水果减肥茶。公开号CN105520007A的中国专利发明了一种石斛猕猴桃复合饮料及其制备方法，该复合饮料可有效地补充人体必需的营养因子，维持膳食平衡。又如公开号CN105361036A的中国专利发明了一种有减肥效果的蛹虫草猕猴桃酵素制作过程。以上专利中发明的含猕猴桃的保健食品，都是基于猕猴桃的传统功效。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种猕猴桃果皮提取物的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将猕猴桃果皮进行脱脂处理，得到脱脂后猕猴桃果皮；

2)将步骤1)得到的脱脂后猕猴桃果皮超声提取，收集上清液，即得到猕猴桃果皮提取物。

上述方法步骤1)中，所述脱脂处理为用有机溶剂对所述猕猴桃果皮进行回流提取，过滤去除所述有机溶剂，得到脱脂处理后猕猴桃果皮；

或所述猕猴桃果皮和所述有机溶剂的配比为1g：(6-20)ml或1g:(10-20)ml；

或所述回流提取的温度为30-90℃，时间为1-12小时或1-7小时；

或步骤2)中，所述超声提取采用的提取液为乙醇水溶液；

所述超声提取为将所述脱脂处理后猕猴桃果皮用乙醇水溶液进行超声提取得到超声产物；再过滤收集所述超声产物的上清液；

所述超声功率大于100W；所述超声的方式为依次超声3次，每次超声的时间为10-30min。(超声为分别依次超声3次，每次超声结束后将超声提取液收集后，更换新溶液，再次超声，一共进行三次。)

上述方法中，步骤2)中，所述乙醇水溶液的体积百分含量为20-95％。

上述方法中，步骤2)中，在所述收集上清液的步骤后，还包括如下步骤：先去除所述上清液中的乙醇，再用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有机相，最后去除所述有机相中的乙酸乙酯，得到猕猴桃果皮提取物。

上述方法中，所述上清液和所述乙酸乙酯的体积比为1:(1-4)。

上述方法中，所述去除所述上清液中的乙醇或所述去除所述有机相中的乙酸乙酯均通过减压浓缩去除；

所述减压浓缩的温度为35-55℃、压力为0.01-0.08MPa。

上述方法中，步骤1)中，在所述脱脂处理前还包括如下步骤：将所述猕猴桃果皮粉碎过20目筛网后，收集过滤后产物。

上述方法中，所述有机溶剂为石油醚。

由上述的方法制备的猕猴桃果皮提取物也是本发明保护的范围。

上述的猕猴桃果皮提取物在抑制脂肪酸合酶或制备抑制脂肪酸合酶产品或制备用于减肥产物或制备用于抗癌产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种抑制脂肪酸合酶的产品。

本发明提供的抑制脂肪酸合酶的产品，其活性成分为上述的猕猴桃果皮提取物。

本发明的实验证明，本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明从猕猴桃果皮中可制取得到一种可以抑制脂肪酸合酶活性的提取物，是一种天然的、植物源的、无毒的脂肪酸合酶抑制剂；

2、本发明得到的猕猴桃果皮提取物可以显著地抑制脂肪酸合酶的活性，其活性大小与目前已知的天然来源的脂肪酸合酶抑制剂，如EGCG等相当；

3、由于脂肪酸合酶活性的强弱直接影响到生物细胞内合成脂肪的多少和肿瘤细胞合成脂肪酸的能力，因此，抑制脂肪酸合酶的活性，一方面可以使生物细胞内合成脂肪的过程弱化，脂肪含量即会得到控制甚至减少；另一方面可以使肿瘤细胞合成脂肪酸的能力下降，从而可以抑制肿瘤细胞的生长；因此，以本发明的提取物作为活性成分制成各种剂型的减肥药物或抗癌药物具有功效活性显著、作用机理清楚、靶点明确等特点，符合药物制剂开发的要求；

4、由于猕猴桃是一种传统的食用植物资源，用本发明从猕猴桃中制取的提取物作为原料制成减肥或抗肿瘤的保健食品、功能化妆品、普通食品等，符合国家对于保健食品及普通食品的原料的限定和法规要求，因此，本发明的具有抑制脂肪酸合酶活性的提取物具有更为广阔的应用开发前景。

总之，本发明不仅丰富了纯天然脂肪酸合酶抑制剂的来源，也开拓了具有地域特色和资源优势的猕猴桃植物新的功效及应用价值。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段做出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。

实施例1、猕猴桃果皮提取物的获得及检测

1、猕猴桃果皮提取物的获得及检测

1)将除去果肉的猕猴桃果皮粉碎过20目筛网后，收集过滤后细粉，再用石油醚在温度30℃下回流提取(细粉和石油醚的配比为1g：10ml)7个小时进行脱脂，过滤除去石油醚，得到经过脱脂的猕猴桃果皮；

2)将步骤1)得到的脱脂后的猕猴桃果皮用体积百分含量为20％的乙醇水溶液浸泡，于常温下(25℃)超声提取(XH-2008DE超声波萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司)，超声功率200W，依次超声3次，每次超声30min，超声后的液体经过滤纸过滤，收集并合并3次超声的液体部分，作为提取物。(先后进行3次超声，每次超声即是一次提取过程，共3次是为了让提取更充分)，用滤纸过滤收集超声产物的上清液(即超声提取物，经过过滤后的液体)，并于温度为35℃、压力为0.08MPa的条件下减压浓缩至无醇味，得到粗提液；

3)向步骤2)得到的粗提液中加入4倍体积的乙酸乙酯，在室温(25℃)下进行萃取并静止待自然分层，收集有机相，于温度为35℃、压力为0.08MPa的条件下减压浓缩至挥尽溶剂，干燥至恒重，即得到猕猴桃果皮提取物A。

2、猕猴桃果皮提取物的检测

1)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，FAS)的制备

脂肪酸合酶FAS的粗提：新鲜鸡肝脏称重后按1:1.8(g/mL)加入4℃的抽提缓冲液(0.1mol/L KH2PO4-K2HPO4，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，0.07mol/L KHCO3，pH 8.0)，匀浆50秒。测量匀浆液体积后以8000r/min速度4℃下离心15min。上清液经纱布过滤，测量体积后，再以35000r/min速度4℃下离心30min。上清液经纱布过滤后分装于耐低温塑料瓶-20℃过夜，剩余置于-80℃保存备用。

硫酸铵分步沉淀：将冷冻的高速离心上清液置水浴化冻，化冻后置于冰盒中，磁力搅拌状态下按三分之一体积量滴加4℃的pH 7.0的饱和硫酸铵(含1mmol/L DTT)至25％饱和度。搅拌10min后用10000r/min速度4℃下离心15min，弃去沉淀。取样测定上清液的FAS活性。

再于搅拌状态下滴加上清液四分之一体积的4℃pH 7.0的饱和硫酸铵(含1mmol/L DTT)至40％饱和度，搅拌10min后用10000r/min离心15min。若测定上清中不含或只含很少FAS活性，弃去上清，保留沉淀。

离子交换层析：DEAE纤维素DE52经处理后用4℃缓冲液A(5mmol/L KH2PO4-K2HPO4含1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH 7.0)平衡。上述沉淀控干后溶于适量4℃缓冲液A，测定电导值不大于5.5ms/cm即可上样。上样后用4℃缓冲液A洗涤至杂蛋白的吸收为0，再依次用4℃50mmol/L、160mmol/L、250mmol/L、1mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(皆含1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH 7.0)洗脱。分别收集洗脱峰，测量体积、蛋白含量及FAS活性。层析过程使用LKB蛋白监测仪和记录仪监测。

亲和层析：Blue Sepharose 6B树脂用4℃缓冲液B(50mmol/L KH2PO4-K2HPO4含1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，pH 7.0)平衡。将DEAE层析的250mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液洗脱收集液上样。上样后用4℃缓冲液B洗涤，再依次用4℃含0.35mol/L、2mol/L NaCl缓冲液B洗脱。分别收集洗脱峰，测量体积、蛋白含量及FAS活性。

浓缩保存：搅拌状态下按含有0.35mol/LNaCl缓冲液B洗脱收集液三分之二体积缓慢加入4℃饱和硫酸铵溶液至40％饱和度以沉淀FAS。搅拌10min后以10000r/min速度4℃下离心15min。弃去上清液，控干沉淀后溶于少量储存缓冲液(0.1mol/L KH2PO4-K2HPO4，1mmol/L EDTA，10mmol/L DTT，20％甘油，pH 7.0)中，使FAS浓度在10mg/mL左右，取少量样品测定蛋白浓度和FAS活性，其余分装完毕后经-20℃过夜后转置-80℃冷冻保存备用，得到脂肪酸合酶(FAS)。

以上分离提纯过程的所有步骤均在4-8℃低温下进行。终样品脂肪酸合酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，分子量为270kD。

2)猕猴桃果皮提取物对脂肪酸合酶的抑制作用

取10mg由1得到的猕猴桃果皮提取物A溶于200mL DMSO中作为受试样品溶液；然后稀释为不同浓度的待测样品溶液。

脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法进行测定(W.X.Tian et al.,1985.J.Biol.Chem.,260(20):11375-11387；田维熙等,1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合酶活性的关系.生物化学杂志，12(2):234-236)。

将一定浓度的待测样品溶液(浓度为1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL)加入测活体系(配方为含有3mM乙酰辅酶A、10mM丙二酸单酰辅酶A、35mM NADPH，浓度为100mM pH为7.0的磷酸盐缓冲液，总体积为2mL)中，37℃恒温，然后加入一定量(单位酶活性为15U/mg)的由1)得到的脂肪酸合酶FAS启动反应，测得酶活性为Ai。加样品溶剂对照测得的酶活性是A0，Ai/A0即为FAS的剩余活性(Remaining Activity，R.A.)。该值越小，则表明样品对FAS的抑制能力越强。这种方法测定的抑制作用通常情况下是可逆的，即表示抑制剂与酶的结合是非共价结合。

脂肪酸合酶(FAS)活性被抑制的程度用IC50(半抑制浓度)来表示，其计算方法为：以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合酶活性值，该值用A0表示，并设定其为100％。底物中加入脂肪酸合酶抑制剂提取液的为实验组，测得其脂肪酸合酶活性的数值为A0的50％时，抑制剂的浓度为IC50值。该值越小，表明样品对FAS的抑制能力越强。

在测活体系中分别加入浓度为1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL猕猴桃果皮提取物后，所测定的脂肪酸合酶相对活性的数值分别为：99％、97％、87％、75％、66％、38％、21％、13％。

结果表明猕猴桃果皮提取物A对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为33.8μg/mL。

从上述结果可以表明，猕猴桃果皮提取物A对脂肪酸合酶的活性有较强的抑制作用，并且所需的有效剂量很低(小于50μg/mL)。

实施例2、猕猴桃果皮提取物的获得及检测

1、猕猴桃果皮提取物的获得及检测

1)将除去果肉的猕猴桃果皮粉碎过20目筛网后，收集过滤后细粉，再用石油醚在温度90℃下回流提取(细粉和石油醚的配比为1g：15ml)3个小时脱脂，过滤除去石油醚，得到经过脱脂的猕猴桃果皮；

2)将步骤1)得到的脱脂后的猕猴桃果皮用体积百分含量为95％的乙醇水溶液浸泡，于常温下(25℃)超声提取(XH-2008DE超声波萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司)，超声功率200W，超声功率200W，依次超声3次，每次超声30min，超声后的液体经过滤纸过滤，收集并合并3次超声的液体部分，作为提取物。并于温度为55℃、压力为0.01MPa的条件下减压浓缩至无醇味(除去乙醇)，得到粗提液；

3)向步骤2)得到的粗提液中加入1倍体积的乙酸乙酯，在室温(25℃)下进行萃取并静止待自然分层，收集有机相，于温度为55℃、压力为0.01MPa的条件下减压浓缩至挥尽溶剂，干燥至恒重，即得到猕猴桃果皮提取物B。

2、猕猴桃果皮提取物的检测

1)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制备

与实施例1的2的1)相同。

2)猕猴桃果皮提取物对脂肪酸合酶的抑制作用

方法与实施例1的2的2)相同，

结果表明猕猴桃果皮提取物B对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为34.0μg/mL。

在测活体系中分别加入浓度为1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL猕猴桃果皮提取物后，所测定的脂肪酸合酶相对活性的数值分别为：98％、95％、90％、77％、62％、35％、17％、11％。

说明猕猴桃果皮提取物B对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低(小于50μg/mL)。

实施例3、猕猴桃果皮提取物的获得及检测

1、猕猴桃果皮提取物的获得及检测

1)将除去果肉的猕猴桃果皮粉碎过20目筛网后，收集过滤后细粉，再用石油醚在温度60℃下回流提取(细粉和石油醚的配比为1g：20ml)1个小时进行脱脂，过滤除去石油醚，得到经过脱脂的猕猴桃果皮；

2)将步骤1)得到的脱脂后的猕猴桃果皮用体积百分含量为50％的乙醇水溶液浸泡，于常温(25℃)下超声提取，超声功率200W，依次超声3次，每次超声30min，超声后的液体经过滤纸过滤，收集并合并3次超声的液体部分，作为提取物。并于温度为55℃、压力为0.1MPa的条件下减压浓缩至无醇味，得到粗提液；

3)向步骤2)得到的粗提液中加入2倍体积的乙酸乙酯在室温(25℃)下进行萃取并静止待自然分层，收集有机相，温度为55℃、压力为0.1MPa的条件下减压浓缩至挥尽溶剂，干燥至恒重，经干燥得到猕猴桃果皮提取物C。

2、猕猴桃果皮提取物的检测

1)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制备

与实施例1的2的1)相同。

2)猕猴桃果皮提取物对脂肪酸合酶的抑制作用

方法与实施例1的2的2)相同，

在测活体系中分别加入浓度为1、2、5、10、20、50、100、200μg/mL猕猴桃果皮提取物后，所测定的脂肪酸合酶相对活性的数值分别为：95％、94％、88％、73％、65％、33％、15％、12％。

结果表明猕猴桃果皮提取物C对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为35.7μg/mL。

说明猕猴桃果皮提取物C对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低(小于50μg/mL)。

对照组：

将浓度分别为5、10、20、40、80、160μg/mL的EGCG加入含有乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH的磷酸盐缓冲液中，37℃恒温，然后加入单位酶活性为10-15U/mg的FAS启动反应，测得酶活性为Ai。脂肪酸合酶(FAS)活性被抑制的程度用IC50(半抑制浓度)来表示，其计算方法为：以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合酶活性值，该值用A0表示，并设定其为100％。底物中加入脂肪酸合酶抑制剂提取液的为实验组，测得其脂肪酸合酶活性的数值为A0的50％时，抑制剂的浓度为IC50值。该值越小，表明样品对FAS的抑制能力越强。

采用上述方法用脂肪酸合酶抑制剂EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯，购自Sigma公司)进行实验，EGCG对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为25μg/mL。