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一种从西兰花种子中提取萝卜硫素的方法

花匠小妙招
2024-11-25 01:53

一种从西兰花种子中提取萝卜硫素的方法

1.本发明属于天然产物分离提取技术领域，特别提供一种从西兰花种子提取萝卜硫素的方法。

背景技术：

2.西兰花(broccoli)，二年生草本植物，是十字花科芸薹属甘蓝的一种变种，又称木立花椰菜、绿菜花、青花菜等，其产品大多是以绿色花球而得名。西兰花的营养价值极高且全面，主要富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素c和胡萝卜素等。此外，西蓝花中矿物质成分比其他蔬菜更全面，钙、磷、铁、钾、锌、锰等含量都很丰富，比同属于十字花科的白菜花高出很多，因此具有“蔬菜皇冠”的美称。日本国家癌症研究中心公布的抗癌蔬菜排行榜上，西蓝花名列前茅。美国《营养学》杂志上，也刊登了西蓝花能够有效预防前列腺癌的研究成果。西蓝花的抗癌作用，主要归功于其中含有的硫代葡萄糖苷。
3.萝卜硫素(1
‑
异硫氰酸
‑4‑
甲磺酰基丁烷，sulforaphane)，又称“莱菔硫烷”，是一种异硫氰酸盐，常温条件下为黄色或无色液体，分子量为177.29，为芥属的十字花科植物所富含的硫代葡萄糖苷水解后的一种水不溶性物质，不同植物中含量不同。其具有诱导细胞凋亡、调节炎性介质等生物学效应。sfn已被研究用于多种疾病，包括呼吸系统、消化系统、心血管系统和肿瘤等。
4.大量的研究表明萝卜硫苷没有生物活性然而水解生成的萝卜硫素却具有多种生理活性，如抑制癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和凋亡、抑制肿瘤转移、抗氧化、免疫调节、抗菌抗炎、皮肤光保护等，近几年的研究还表明萝卜硫素对ⅱ型糖尿病、精神分裂症阴性症状与认知症状、心血管疾病以及保护孕期饮酒妇女的胎儿血管发育等均有一定作用。
5.近年来，随着各界学者对萝卜硫素研究的逐渐深入，高纯度萝卜硫素的需求越来越大。萝卜硫素的获得方法主要有合成法、半合成法和酶解法。化学合成法是通过手性化学的方法合成萝卜硫素，但由于萝卜硫素本身存在光学异构体，化学反应过程难以控制，重现性差且回收率低，且过程中使用大量有毒试剂，对环境不友好，因而并未得到广泛应用；专利《一种从西兰花中提取萝卜硫素的方法(cn 103436565 a)》、《一种萝卜硫素的提取方法(cn 106349133 a)》均应用半合成法，这种方法在提取硫代葡萄糖苷前要经过灭酶处理，生成的萝卜硫苷还需要加入外源硫代葡萄糖苷酶水解得到萝卜硫素，且转化效率低，需要建立外援黑芥子酶的生产线或高价购买，增加生产成本。
6.为得到萝卜硫素精品，进一步纯化是需要的。萝卜硫素纯化方法有大孔树脂吸附法、硅胶柱色谱法、反向高效制备液相色谱法等。matusheski nathan v.等人(matusheski nathan v.,wallig,matthew a.,juvik,john a.,et al.preparative hplc method for the purification of sulforaphane and sulforaphane nitrile from brassica oleracea[j].journal of agricultural and food chemistry,2001,49(4):1867
–
1872.)采用高效制备液相法进行萝卜硫素纯化。该方法虽然可以获得高纯度产品，但纯化时需要的制备型反相c18高效液相色谱柱价格昂贵，成本高；为保证产品质量，进样量少(一次为1
～2ml)，且需要大量流动相(一周期为200～300ml乙腈水溶液)；由于产品是根据出峰时间进行收集，因此不可避免的会因为人为因素造成产品损失；为获得单品，需将收集的洗脱液进行干燥，由于水相占比较高，难以旋出，因此需要消耗大量的时间或外援溶剂将其旋干。由此可见，制备高效液相法纯化萝卜硫素仅适合实验室规模制备少量产品，难以大规模生产。
[0007]
专利《一种莱菔硫烷的制备方法(cn 104130171 a)》公开了一种从芸苔属蔬菜中提取萝卜硫素的方法。水提后采用大孔吸附树脂进行纯化，收集含有萝卜硫素的洗脱液，冷冻干燥后得到纯度30％～40％的萝卜硫素。虽然大孔树脂吸附法纯化的成本低，但萝卜硫素在大孔树脂上的吸附是一个快吸附过程，因而吸附分离的时间较短，萝卜硫素纯度稍低。
[0008]
专利《一种提取萝卜硫素的方法(cn 101143842 a)》公开了一种提取萝卜硫素的方法。超声辅助提取后，采用硅胶层析柱与sephadex lh
‑
20层析柱联用的方法进行纯化，最终可得到纯度为80％的萝卜硫素产品。sephadex lh
‑
20价格较贵，提取成本较高，且湿法上样前要将样品过滤，否则容易将sephadex lh
‑
20堵住而弃去。专利《一种萝卜硫素的提取方法(cn101544995a)》提供了一种萝卜硫素提取方法的改进，采用c18硅胶装柱，先经硅胶柱层析(采用乙酸乙酯/乙醇体系梯度洗脱)后经反相硅胶柱层析(采用甲醇/水体系梯度洗脱)两步柱层析法进行纯化，最终可得到纯度95％的萝卜硫素产品。该纯化较为复杂，在第一步洗脱前需用三倍柱体积的乙酸乙酯进行除杂，且乙酸乙酯/乙醇体系梯度洗脱操作需进行三次，增加溶剂损耗。另外，c18硅胶较于普通层析柱硅胶成本较高。

技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种从西兰花种子提取萝卜硫素的方法。
[0010]
为实现上述目的，本发明技术方案如下：
[0011]
一种从西兰花种子中提取萝卜硫素的方法，以西兰花种子为原料酶解后获得粗提液，粗提液经液液萃取进行分离，得到萝卜硫素粗品；粗品以硅胶为固定相，通过柱层析获得纯度大于90％的萝卜硫素纯品。
[0012]
进一步的说：
[0013]
1)西兰花种子粗提液的制备：将西兰花种子粉碎，粉碎后脱脂，脱脂后的种子粉中加入去离子水于30℃～40℃水浴酶解2～4h，而后醇提获得西兰花种子粗提液；
[0014]
2)萝卜硫素粗品的分离：将西兰花种子粗提液抽滤，滤液浓缩，浓缩液经乙酸乙酯反复萃取收集萃取相，浓缩得到萝卜硫素粗提物；将萝卜硫素粗提物用含10％～40％乙醇的水溶液(v/v)混合得粗品溶液，粗品溶液再经乙酸乙酯反复萃取收集萃取相，萃取相中加入过量无水硫酸钠至溶液澄清，而后浓缩，浓缩液溶于正己烷
‑
乙醇体系中，混合后通过硅胶柱层析，以不同比例的正己烷
‑
乙醇溶液作为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱组分；
[0015]
3)萝卜硫素粗品的纯化：取上述洗脱组分溶于正己烷
‑
乙醇体系中，再经硅胶柱层析，以二氯甲烷
‑
甲醇作为洗脱液进行洗脱，收集第一条色带的洗脱组分，即获得含量90％以上的目标物纯品。
[0016]
所述步骤1)分散后种子粉经石油醚进行脱脂，脱脂后的种子粉与去离子水按1:4～6(w/v)混合，混合后水浴中酶解，酶解后加入无水乙醇，超声(280～360w，脉冲间隔3～8s)辅助提取30～40min后静置，得到西兰花种子粗提液。
[0017]
所述步骤2)浓缩液与正己烷
‑
乙醇(6:4,v/v)混合后通过硅胶(200～300目)柱层析，上样量为2.5～5g萝卜硫素粗品，且粗品与硅胶的质量比控制在1:3～8，上样流速控制在0.5～1ml/min，而后以体积比6～4:4～6的正己烷
‑
无水乙醇作为洗脱液，以3～10ml/min流速进行梯度洗脱，收集第35min到85min的洗脱液。
[0018]
所述步骤2)中浓缩液与正己烷
‑
乙醇按1:4～8(w/v)比例混合，其中，正己烷
‑
乙醇体系中正己烷与乙醇体积比为6:4。
[0019]
所述步骤3)取上述洗脱组分，浓缩，与二氯甲烷/甲醇体系按质量体积比1:8～13混合，混合后通过硅胶(200～300目)柱层析，上样量为80～120mg萝卜硫素粗品，且粗品量与层析柱硅胶的质量比需控制在1:125～200，上样流速控制在0.3～0.8ml/min，而后以二氯甲烷/甲醇体系，体积比为30:1作为洗脱液，以2～4ml/min流速进行梯度洗脱，收集第一条色带全部洗脱组分，即获得含量90％以上的目标物纯品。
[0020]
所述步骤3)中，当目标化合物洗脱收集完毕后(约20～30min)，将甲醇浓度提升至100％，进行层析柱清洗(约5min)，清洗完毕后，采用两倍柱体积二氯甲烷/甲醇(30:1，v/v)洗脱体系平衡。
[0021]
本发明的有益效果为：
[0022]
本发明采用酶解的方法制备西兰花种子粗提液，以液液萃取和低压柱层析相结合的方式从西兰花种子粗提液中分离，可得到纯度为60％～70％的萝卜硫素粗品，提取率为4.5％～4.8％。通过硅胶柱层析法纯化，经高效液相色谱、质谱和核磁共振测定最终得到的萝卜硫素含量≥90％。硅胶柱层析一次上样量为80～120mg萝卜硫素粗品，纯化后的损失率为15％～25％，耗费洗脱液为80～100ml，洗脱时间为20～30min。
[0023]
为保证洗脱质量，制备高效液相色谱的一次上样量为25～40mg萝卜硫素粗品，纯化后的损失率为30％～35％，耗费洗脱液为360ml，流速为9ml/min，洗脱时间为40min。(以上数据均为实验室所得)。
[0024]
本专利方法重现性好，溶剂消耗量低，操作简单且成本低。采用本方法能够方便快捷低成本的得到高纯度萝卜硫素，具有切实的经济效益。
附图说明
[0025]
图1：从西兰花种子粗提液中得到的萝卜硫素的高效液相色谱图；
[0026]
图2：制备型柱层析分离后得到的萝卜硫素的高效液相色谱图；
[0027]
图3：制备型柱层析纯化后得到的萝卜硫素的高效液相色谱图；
[0028]
图4：从西兰花种子粗提液中分离、纯化最终得到的萝卜硫素纯品的质谱图；
[0029]
图5：从西兰花种子粗提液中分离、纯化最终得到的萝卜硫素纯品的碳谱图，13c nmrδ：53.5，44.6，38.7，29.0，和20.1ppm；
[0030]
图6：从西兰花种子粗提液中分离、纯化最终得到的萝卜硫素纯品的氢谱图，1h nmrδ3.60(t，2h，ch2ncs)，2.80
‑
2.66(m，2h，ch2so)，2.60(s，3h，ch3so)，和1.99
‑
1.86ppm(m,4h,ch2ch2)。
具体实施方式
[0031]
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描
述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0032]
本发明应用硅胶柱色谱法，以液液萃取和制备型柱层析相结合的方式从西兰花种子粗提液中分离萝卜硫素粗品，具体为，西兰花种子脱脂、酶解、提取后，通过硅胶柱层析分离纯化萝卜硫素，以硅胶为固定相，流动相选用乙醇/正己烷、二氯甲烷/甲醇体系，获得高收率的萝卜硫素。最终可得到含量≥90％的萝卜硫素纯品。与制备高效液相色谱法相比，本专利方法重现性好，溶剂消耗量低，整个过程操作简便，易于工业化生产。采用本方法能够方便快捷低成本的得到高纯度萝卜硫素，具有切实的经济效益。
[0033]
实施例1
[0034]
1)西兰花种子粗提液的制备：称取50g西兰花种子用研磨机打磨成粉，加入石油醚进行脱脂。按料液比1:4(w/v)，向脱脂后的种子粉中加入200ml去离子水，30℃水浴酶解2h。加入适量无水乙醇，超声(360w，脉冲间隔3s)辅助提取30min后静置，得到西兰花种子粗提液(参见图1)。
[0035]
2)萝卜硫素粗品的分离：将西兰花种子粗提液抽滤，滤液于旋转蒸发器(真空，35℃)中浓缩，回收乙醇。乙酸乙酯萃取3次，收集萃取相，于旋转蒸发器(真空，35℃)中浓缩，得到萝卜硫素粗提物。将萝卜硫素粗提物溶于10％乙醇溶液，得到粗品溶液，用正己烷洗去非极性杂质。然后用乙酸乙酯萃取，收集萃取相，加入过量无水硫酸钠至溶液澄清。过滤，滤液浓缩。将2.51g浸膏(含10％的萝卜硫素)，溶于2ml正己烷/乙醇(6:4，v/v)中。取17.6g的柱层析硅胶(200～300目)，加入适量正己烷，搅拌均匀，装入层析柱中，加入适量石英砂作为缓冲层。控制上样流速为0.5ml/min，用正己烷/乙醇体系，按40～60％浓度的乙醇进行梯度洗脱，洗脱液流速控制在3ml/min，收集第35min到第85min的洗脱液，取适量洗脱液过0.22μm滤膜，经hplc检测后得到0.34g纯度69％的萝卜硫素粗品(参考图2)。
[0036]
3)萝卜硫素粗品的纯化：取0.08g萝卜硫素粗品，溶于2ml二氯甲烷/甲醇(30:1，v/v)体系。称取10g的柱层析硅胶(200～300目)，加入适量二氯甲烷，搅拌均匀，装入层析柱中，加入适量石英砂作为缓冲层。以0.3ml/min的流速上样后，按照二氯甲烷:甲醇＝30:1(v/v)的洗脱体系，并保持2ml/min的流速进行等度洗脱。收集第一条色带的全部洗脱液。整个过程，消耗洗脱液50ml，洗脱时间25min。收集第一条色带的洗脱液，于30℃真空下浓缩即得到纯化产物。取少量纯化产品溶于乙腈，过0.22μm滤膜，经hplc检测后得到49.8mg纯度92％的萝卜硫素纯品(参考图3)，计算纯化损失率为17.0％。并以质谱与核磁作为辅助手段验证其纯度(参考图4、5、6)。因此，每千克西兰花种子按本专利提取方法可以得到4.233g纯度为92％的萝卜硫素纯品
[0037]
实施例2
[0038]
1)西兰花种子粗提液的制备：称取50g西兰花种子用研磨机打磨成粉，加入石油醚进行脱脂。按料液比1:4(v/v)，向脱脂后的种子粉中加入200ml去离子水，30℃水浴酶解4h。加入适量无水乙醇，超声(360w，脉冲间隔2s)辅助提取1h后静置，得到西兰花种子粗提液。
[0039]
2)萝卜硫素粗品的分离：将西兰花种子粗提液抽滤，滤液于旋转蒸发器(真空，35℃)中浓缩，回收乙醇。乙酸乙酯萃取3次，收集萃取相，于旋转蒸发器(真空，35℃)中浓缩，得到萝卜硫素粗提物。将萝卜硫素粗提物用10％乙醇(v/v)，得到粗品溶液，用正己烷洗掉非极性杂质。然后用乙酸乙酯萃取3次，收集萃取相，加入过量无水硫酸钠至溶液澄清。过滤，滤液浓缩。将2.47g粗品(含11％的萝卜硫素)，溶于3ml正己烷/乙醇(6:4，v/v)中。取
23.5g的柱层析硅胶(200～300目)，加入适量正己烷，搅拌均匀，装入层析柱中，加入适量石英砂作为缓冲层。控制上样流速为0.5ml/min，用正己烷/乙醇体系，按40～60％浓度的乙醇进行梯度洗脱，洗脱液流速控制在3ml/min，收集第35min到第85min的洗脱液，取适量洗脱液过0.22μm滤膜，经hplc检测后得到0.38g纯度62％的萝卜硫素粗品。
[0040]
3)萝卜硫素粗品的纯化：取0.11g萝卜硫素粗品，溶于2ml二氯甲烷/甲醇(30:1，v/v)体系。称取14.3g的柱层析硅胶(200～300目)，加入适量二氯甲烷，搅拌均匀，装入层析柱中，加入适量石英砂作为缓冲层。以0.3ml/min的流速上样后，按照二氯甲烷:甲醇＝30:1(v/v)的洗脱体系，并保持2ml/min的流速进行等度洗脱。收集第一条色带的全部洗脱液。整个过程，消耗洗脱液约54ml，洗脱时间27min。收集第一条色带的洗脱液，于30℃真空下浓缩即得到纯化产物。取少量纯化产品溶于乙腈，过0.22μm滤膜，取适量洗脱液过0.22μm滤膜，经hplc检测后得到纯度91％的萝卜硫素61.4mg，计算损失率为18.1％。因此，每千克西兰花种子按本专利提取方法可以得到4.242g纯度为91％的萝卜硫素纯品。
[0041]
对比例1
[0042]
1)西兰花种子粗提液的制备：称取50g西兰花种子用研磨机打磨成粉，加入石油醚进行脱脂。按料液比1:4(w/v)，向脱脂后的种子粉中加入200ml去离子水，30℃水浴酶解2h。加入适量无水乙醇，超声(360w，脉冲间隔3s)辅助提取30min后静置，得到西兰花种子粗提液
[0043]
2)萝卜硫素粗品的分离：将西兰花种子粗提液抽滤，滤液于旋转蒸发器(真空，35℃)中浓缩，回收乙醇。乙酸乙酯萃取3次，收集萃取相，于旋转蒸发器(真空，35℃)中浓缩，得到萝卜硫素粗提物。将萝卜硫素粗提物用10％乙醇(v/v)，得到粗品溶液，用正己烷洗掉非极性杂质。然后用乙酸乙酯萃取3次，收集萃取相，加入过量无水硫酸钠至溶液澄清。过滤，滤液浓缩。将2.01g浸膏(含12％的萝卜硫素)，溶于2ml正己烷/乙醇(6:4，v/v)中。取14.1g的柱层析硅胶(200～300目)，加入适量正己烷，搅拌均匀，装入层析柱中，加入适量石英砂作为缓冲层。按0.5ml/min的流速上样，用正己烷/乙醇体系，按40～60％浓度的乙醇，保持10ml/min进行梯度洗脱，收集第35min到第85min的洗脱液，取适量洗脱液过0.22μm滤膜，经hplc检测后得到0.26g纯度52％的萝卜硫素粗品。
[0044]
3)萝卜硫素粗品的纯化：取0.16g萝卜硫素粗品，溶于2ml二氯甲烷/甲醇(30:1，v/v)体系。称取20g的柱层析硅胶(200～300目)，加入适量二氯甲烷，搅拌均匀，装入层析柱中，加入适量石英砂作为缓冲层。以0.3ml/min的流速上样后，按照二氯甲烷:甲醇＝30:1(v/v)的洗脱体系，并保持2ml/min的流速进行等度洗脱。收集第一条色带的洗脱液，于30℃真空下浓缩即得到目标化合物。整个过程，溶剂消耗量为50ml，洗脱时间为25min。收少适量纯化产品溶于乙腈过0.22μm滤膜，经hplc检测后得到76.82mg纯度87％的萝卜硫素，计算损失率为19.7％。
[0045]
对比例2
[0046]
与专利《一种提取萝卜硫素的方法(cn 101143842 a)》、专利《一种萝卜硫素的提取方法(cn 101544995 a)》以及matusheski nathan v.等人(matusheski nathan v.,wallig,matthew a.,juvik,john a.,et al.preparative hplc method for the purification of sulforaphane and sulforaphane nitrile from brassica oleracea[j].journal of agricultural and food chemistry,2001,49(4):1867
–
1872.)方法比较
如下表：
[0047]
各纯化方法与本专利对比
[0048][0049]
由上表可以看出，本专利使用较为便宜的硅胶层析柱进行纯化，在保证纯度与提取量的同时，还能减少溶剂损耗，降低成本，能够方便快捷低成本的得到高纯度萝卜硫素。
[0050]
本发明未尽事宜为公知技术。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。